Garviecin LG34抗菌机理研究

高玉荣，崔素萍，徐国栋，李大鹏，张丽媛，王欣

Garviecin LG34抗菌机理研究

高玉荣，崔素萍，徐国栋，李大鹏，张丽媛，王欣

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319）

以金黄色葡萄球菌为指示菌，研究了细菌素Garviecin LG34对革兰氏阳性菌的抗菌机理。结果表明，Garviecin LG34导致金黄色葡萄球菌细胞内的K+及260 nm和280 nm处紫外吸收物质的大量渗漏，并导致平均通道荧光强度（MnX）的显著提高。Garviecin LG34导致了金黄色葡萄球菌细胞膜上形成了较大的孔洞，细胞膜的渗透性增大，从而导致细胞死亡。

细菌素；Garviecin LG34；金黄色葡萄球菌；抗菌机理

0 引言

随着人们健康意识的增强及对食品安全的重视程度逐渐提高，开发新型安全高效的抗菌剂进行食品防腐保藏已经成为食品工业的重要发展方向。乳酸菌细菌素是由乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的具有抗菌活性的多肽类物质[1]。与化学防腐剂相比，乳酸菌细菌素在起到抑菌杀菌作用的同时，对人体没有任何毒副作用，可以被人体的蛋白酶水解成氨基酸，因此被国内外公认为安全的生物防腐剂[2]。

课题组在前期的研究中，从发酵酸黄瓜中筛选到1株产新型广谱乳酸菌细菌素的Lactococcus garvieae LG34（格氏乳球菌），并对其产生的细菌素Garviecin LG34（格氏乳球菌素）进行了分离纯化，发现分子量和抑菌谱不同于目前已发现的格氏乳球菌素，是一种新型广谱的细菌素，不仅能抑制革兰氏阳性菌，也能抑制革兰氏阴性菌，具有作为生物防腐剂的应用前景[3-4]。为了更好地进行Garviecin LG34在食品中的应用研究，试验以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌为指示菌，探讨了Garviecin LG34对革兰氏阳性菌的抗菌机理，为新型广谱生物防腐剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 Garviecin LG34

将Lactococcus garvieae LG34斜面菌种1~2环转接到装有10mLMRS液体培养基的试管中混合均匀，于28~30℃条件下培养18 h，按2%接种量接入装有200mL的MRS液体培养基中，于30℃条件下发酵36 h。将发酵液离心（6 000 r/min，15 min），将上清液的pH值调整至7.0，用旋蒸仪浓缩10倍。用4倍冷乙醇沉淀处理，取上清液用旋蒸仪浓缩至原体积的1/2。

1.1.2 指示菌

金黄色葡萄球菌ATCC 63589，黑龙江八一农垦大学微生物实验室保藏。

1.2 试验方法

1.2.1 Garviecin LG34对细胞内K+渗漏的影响

将金黄色葡萄球菌ATCC 63589过夜培养的菌悬液，加入Garviecin LG34，终浓度为320 AU/mL。于37℃条件下放置，隔20min取样，菌液于0℃条件下以转速10 000 r/min离心7min。采用M5型原子吸收光谱仪测定上清液中的K+浓度。

1.2.2 Garviecin LG34对260 nm紫外吸收物质渗漏的影响

将处于对数期的10 mL OD600为0.8~1.0的金黄色葡萄球菌ATCC 63589，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5灭菌磷酸缓冲溶液清洗2次。然后用320 AU/mL细菌素Garviecin LG34处理，在37℃条件下处理0，20，40，60，80，100min后，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体，上清液经0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。于波长260 nm处测定细胞悬浮液的吸光度，以菌体悬浮在不含细菌素的纯净水中作为空白对照[5]。

1.2.3 Garviecin LG34对280 nm紫外吸收物质渗漏的影响

将处于对数期的10 m L OD600为0.8~1.0的金黄色葡萄球菌ATCC 63589，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5灭菌磷酸缓冲溶液清洗2次。然后用320 AU/mL细菌素Garviecin LG34处理，在37℃条件下处理0，20，40，60，80，100min后，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体，上清液经0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。于波长280 nm处测定细胞悬浮液的吸光度，以菌体悬浮在不含细菌素的纯净水中作为空白对照[5]。

1.2.4 Garviecin LG34对细胞内核酸类物质渗漏的影响

处于对数期的10mLOD600为0.8~1.0的金黄色葡萄球菌ATCC 63589，以转速6 000 r/min离心15min离心收集菌体，用10mL的5mmol/L pH值6.5灭菌磷酸缓冲溶液清洗2次。然后用抑菌Garviecin LG34处理，在37℃条件下处理30 min和60 min后，以转速6 000 r/min离心15min收集菌体。以菌体悬浮在不含Garviecin LG34的纯净水中作为空白对照，以碘化丙啶（PI）为染色剂，用流式细胞仪分析试验样品与对照样品的PI荧光强度[6]。

2 结果与讨论

2.1 Garviecin LG34对细胞内K+渗漏的影响

细胞内K+是否大量渗漏到细胞外，能反映其细胞通透性的提高，为了研究Garviecin LG34对细胞通透性的影响，试验研究了细菌素作用金黄色葡萄球菌后细胞内K+渗漏的情况。

对金黄色葡萄球菌细胞内K+泄露的影响见图1。

图1 对金黄色葡萄球菌细胞内K+泄露的影响

由图1可知，细菌素Garviecin LG34作用金黄色葡萄球菌20min以后，细胞内的K+大量渗漏到细胞外，与空白对照相比差异显著；作用80 min后，渗漏减慢。

2.2 Garviecin LG34对细胞内260 nm紫外吸收物质渗漏的影响

核酸类物质的最大吸收峰为260 nm，核酸物质的渗漏情况能反映出细胞膜上大孔洞的形成情况，因此试验研究了Garviecin LG34对金黄色葡萄球菌细胞内260 nm紫外吸收物质渗漏的影响。

对金黄色葡萄球菌细胞内260 nm紫外吸收物质泄露的影响见图2。

图2 对金黄色葡萄球菌细胞内260 nm紫外吸收物质泄露的影响

核酸最大吸收波长为260 nm，于波长260 nm处的光密度通常被用来评价核酸的浓度。由图2可知，用Garviecin LG34处理金黄色葡萄球菌40 min后，于波长260 nm处的ΔOD显著高于用蒸馏水处理的空白样品。结果表明，用Garviecin LG34处理后，细胞内260 nm紫外吸收物质可以大量渗透到细胞外。

2.3 Garviecin LG34对细胞内280 nm紫外吸收物质渗漏的影响

蛋白质的最大吸收波长为280 nm，因此在280 nm的光密度通常被用来评价蛋白质的浓度，细胞内蛋白质的渗漏情况能反映出细胞膜上大孔洞的形成情况，因此试验研究了Garviecin LG34对金黄色葡萄球菌细胞内280 nm紫外吸收物质渗漏的影响。

对金黄色葡萄球菌细胞内280 nm紫外吸收物质泄露的影响见图3。

图3 对金黄色葡萄球菌细胞内280 nm紫外吸收物质泄露的影响

由图3可知，用Garviecin LG34处理金黄色葡萄球菌40min后，于波长280 nm处的ΔOD显著高于用蒸馏水处理的空白样品。这些结果表明用Garviecin LG34处理后，细胞内280 nm紫外吸收物质可以大量渗透到细胞外。

2.4 流式细胞仪测定细胞的通透性

流式细胞仪目前被广泛用于细胞损伤的研究中，主要的评价指标为平均通道荧光强度（MnX）。试验研究了用Garviecin LG34处理金黄色葡萄球菌对细胞通透性的影响。

用Garviecin LG34处理后金黄色葡萄球菌的平均通道荧光强度见表1。

表1 用Garviecin LG34处理后金黄色葡萄球菌的平均通道荧光强度

由表1可知，用Garviecin LG34处理30 min和60min后，MnX从2.66分别提高到5.23和6.43。这说明Garviecin LG34的处理导致了金黄色葡萄球菌细胞中碘化丙锭掺入量的增加，说明细胞膜的渗透性增大，在细胞膜上形成了较大的孔洞。

3 结论

细菌素Garviecin LG34作用金黄色葡萄球菌20min以后，细胞内的K+大量渗漏到细胞外，与空白对照相比差异显著；在作用80 min后，渗漏减慢。用Garviecin LG34处理后，细胞内260 nm和280 nm紫外吸收物质可以大量渗透到细胞外。用Garviecin LG34处理30 min和60 min后，MnX从2.66分别提高到5.23和6.43。这说明Garviecin LG34的处理导致了金黄色葡萄球菌细胞中碘化丙锭掺入量的增加，说明细胞膜的渗透性增大，在细胞膜上形成了较大的孔洞。

[1]刘国荣，李平兰，王成涛.乳酸菌细菌素作为天然生物防腐剂在食品工业中的应用进展[J].北京工商大学学报（自然科学版），2012（2）：64-69.

[2]丹彤，张和平.乳酸菌细菌素的分类、生物合成及其应用[J].中国乳品工业，2013，41（3）：29-32.

[3]Yurong Gao，Dapeng Li，Shan Liu，etal.Garviecin LG34，a novel bacteriocin produced by Lactococcus garvieae isolated from traditional Chinese fermented cucumber[J].Food Control，2015（5）：896-899.

[4]刘姗，高玉荣.格氏乳球菌素LG34生物稳定性的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（3）：67-70.

[5]翟培，韩晋辉，侯丽霞，等.家蝇抗菌肽的抑菌动力学研究及其机理初探[J].中国生物工程杂志，2006，26（11）：33-39.

[6]乔长庚.温和压力对酵母活性与犁头霉生物转化的影响[D].天津：天津科技大学，2005.◇

AntimicrobialMechanism of Garviecin LG34

GAO Yurong，CUISuping，XUGuodong，LIDapeng，ZHANG Liyuan，WANG Xin
（Food College，Heilongjiang BayiAgricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

Using Staphylococcusaureus as indicator strain，the antimicrobialmechanism of Garviecin LG34 againstGram-positive bacteria is researched.The results show that Garviecin LG34 led to the great leakage of K+，and cell substance absorbing ultraviolet in 260 nm and 280 nm，and the significant increase in MnX.Garviecin LG34 results in the produce of large hole in the cellmembrane of Staphylococcus aureus and the leakage increase and finially led the cell dead.

bacteriocin；Garviecin LG34；Staphylococcus aureus；antimicrobialmechanism

Q93

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.005

1671-9646（2017）04a-0014-03

2017-03-19

黑龙江省教育厅科学技术研究（面上）项目（12541589）。

高玉荣（1970—），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为食品微生物及发酵工程方面的教学及研究。