银杏叶叶绿素荧光特性及其含量测定研究

王卓渊　林香凤

摘要 [目的]研究银杏叶叶绿素的荧光特征及其含量的变化规律。[方法]以新鲜银杏叶为材料，采用混合有机溶剂进行萃取，并用分光光度法对银杏叶叶绿素的含量进行测定，通过比较不同月份银杏叶叶绿素的含量，得到叶绿素含量的变化规律，同时研究银杏叶叶绿素的特征荧光发射峰和磷光寿命。[结果]银杏叶叶绿素有2个特征荧光发射峰，分别位于691和718 nm处，在2个发射峰处的磷光寿命分别为8.61和8.21 μs；在不同月份的银杏叶中，叶绿素含量从大到小依次为7月、4月、11月，但叶绿素a/b比值从大到小依次为4月、11月、7月。[结论]该研究为银杏叶叶绿素的进一步研究提供参考。

关键词银杏叶；叶绿素；荧光特征；含量测定；分光光度法

中图分类号S792.95；R282文献标识码A文章编号0517-6611（2017）31-0134-03

Abstract[Objective] The research aimed to study fluorescence characteristics and content variance of chlorophyll in ginkgo leaves.[Method]Fresh ginkgo leaves were used as raw material， chlorophyll was extracted by mixed organic solvent and its content was measured with spectrophotometry.Chlorophyll contents in ginkgo leaves in different months were compared to obtain variance of chlorophyll content， and characteristic fluorescence peaks and phosphorescence lifetimes of chlorophyll were studied.[Result]The chlorophyll of ginkgo leaves had two characteristic fluorescence peaks and they were located at 691 nm and 718 nm， and the phosphorescence lifetimes of chlorophyll of ginkgo leaves were 8.61 and 8.21 μs at two emission peaks respectively. The chlorophyll content in ginkgo leaves in July was the highest，and that in April ranked the second，and that in November was the lowest.However， the order of chlorophyll a/b value in different months was April > November > July.[Conclusion]This study provides guidance for further research of chlorophyll in ginkgo leaves.

Key wordsGinkgo leaves；Chlorophyll；Fluorescence characteristics；Content determination；Spectrophotometry

葉绿素是植物叶片中重要的活性物质，在植物生长发育过程的光合作用中起着关键的作用，直接参与光能的吸收、传递和转化等过程。植物叶片中叶绿素a、b的含量和叶绿素总含量与叶片净光合速率有直接关系[1-2]，叶绿素含量与作物的产量呈正相关[3-4]，通过选择高叶绿素含量的作物品种，就可能成为提高作物产量的探索方法。

与叶绿素光合作用密切相关的是叶绿素荧光性质，它是植物吸收光能的传递、分配和转化的另一种途径，叶绿素光合作用和叶绿素荧光都需要光的能量。叶绿素的荧光性质与叶绿素的含量密切相关[5]，叶绿素的荧光参数可以用于表征植物对光能的利用效率[6]。

药理研究表明，植物叶绿素及其衍生物具有抗菌消炎功能，可用于治疗口腔溃疡[7]；具有抗突变和抗癌等活性[8]，广泛应用于医药和医疗中，日益受到人们的重视。

笔者采用混合有机溶剂，萃取了银杏叶中叶绿素，并利用分光光度法测定银杏叶中叶绿素的含量，分析了不同月份银杏叶中叶绿素含量的变化规律，同时研究了银杏叶中叶绿素的特征荧光发射峰和磷光寿命，为银杏叶叶绿素的进一步研究提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料。银杏叶采自桂林市育才路广西师范大学校园内，生长期为3年以上，采样时间为4—11月，所采集的银杏叶是当时银杏树下部相对最成熟的叶片。

1.1.2主要仪器。法国Jobin Yvon Fluorolog-3时间分辨荧光光谱仪，上海佑科721可见分光光度计。

1.1.3主要试剂。所用丙酮和无水乙醇均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

1.2方法

1.2.1叶绿素的提取及含量测定方法。将采集的新鲜银杏叶洗净，用滤纸吸干，去掉叶梗，剪碎。采用万分之一天平，准确称取样品0.100 0 g左右，放入比色管中，加入10 mL体积比为1∶2的丙酮与无水乙醇混合溶剂，在室温下避光浸泡24 h，将提取溶液过滤。准确移取滤液，置于光径为1.0 cm的比色皿中，以丙酮与无水乙醇混合溶剂为参比，在可见分光光度计中测定吸光度，再根据提取溶液在645和663 nm处的吸光度，由Amon公式[9]计算叶绿素a和叶绿素b的含量：

Ca（mg/g）=（12.7×A663-2.69×A645）×V/（1 000W）

Cb（mg/g）=（22.7×A645-4.68×A663）×V/（1 000W）

C总（mg/g）=Ca+Cb

式中，A645和A663分别为波长在645和663 nm处的吸光度值，Ca和Cb分别为叶绿素a和叶绿素b的含量，C总为叶绿素的总含量，V为提取溶液的体积，W为叶片样品的质量。

1.2.2

叶绿素荧光光谱测定方法。将银杏叶叶绿素提取溶液置于荧光比色皿中，采用时间分辨荧光光谱仪，测定提取溶液中叶绿素的荧光激发谱，再以荧光激发谱中各个激发峰所处波长为激发波长，测定叶绿素的荧光发射谱。

1.2.3

叶绿素磷光寿命测定方法。采用时间分辨荧光光谱仪，按照荧光发射峰所对应的激发波长和发射波长，设置激发单色仪的波长和发射单色仪的波长，测定提取溶液中银杏叶叶绿素的磷光衰减曲线，再以单指数函数进行拟合计算，求得叶绿素的磷光寿命。

2结果与分析

2.1银杏叶叶绿素的吸收光谱特征

采用Origin 7.0软件，处理银杏叶叶绿素提取溶液的吸光度数据，得到银杏叶叶绿素的吸收光谱，如图1所示。从图1可看出，在蓝紫光区的400～460 nm和红光光区的640～680 nm，银杏叶叶绿素有2个强吸收谱带，吸收峰分别位于431和661 nm处，与桑叶叶绿素的吸收光谱[10]非常相似。

2.2不同月份银杏叶中叶绿素含量的变化

银杏是落叶植物，在不同的月份，因温度和所受光照强度不同，银杏叶片的发育成熟程度不同，其中叶绿素的含量也有所不同，测定结果见表1。从表1可看到，7月份银杏叶中叶绿素的含量最高，但叶绿素a/b的比值最低，为2.03；4月份银杏叶中叶绿素的含量稍低，叶绿素a/b的比值最高，为2.32；11月份银杏叶中叶绿素的含量最低，叶绿素a/b的比值居中，为2.15。显然，与4月份的银杏叶相比，7月份的银杏葉发育更加成熟完善，具有较高的叶绿素含量和较低的叶绿素a/b比值，这是曾经引起人们关注的问题[2]，主要是由于叶绿素b的含量很低，它的微小变化更容易调节叶绿素a与叶绿素b的比例关系，在改变叶绿素a/b比值时起着关键的作用。

2.3银杏叶叶绿素的荧光光谱

从图2可看出，在可见光区有2个激发谱带与图1的吸收谱带相对应。银杏叶叶绿素的特征荧光激发峰位于524、544和687 nm处，以各个激发峰所处波长为激发波长，测定荧光发射谱，所得的荧光发射谱均有2个特征荧光发射峰，而且发射峰的位置相同，如图3所示。

由图3可知，银杏叶叶绿素的特征荧光发射峰在红光波段位于691 nm处，在远红光波段位于718 nm处。银杏叶叶绿素的荧光发射谱与桑叶叶绿素的荧光发射谱[10]很相似，是典型的高等植物叶绿素的荧光发射谱。

2.4银杏叶叶绿素的磷光寿命

在银杏叶叶绿素的691和718 nm 2个发射峰处，分别测得银杏叶叶绿素的磷光衰减曲线，结果发现（图4），2条衰减曲线相互交错，几乎重叠。采用单指数函数进行拟合，当拟合参数R2为0.902 2时，求得银杏叶叶绿素在691 nm峰处的磷光寿命为8.61 μs；当R2为0.913 2时，得到银杏叶叶绿素在718 nm峰处的磷光寿命为8.21 μs，二者非常相近。

3结论与讨论

对叶绿素含量进行准确测定是植物生理学研究的重要内容，叶绿素a含量、叶绿素b含量及叶绿素总含量的多少直接影响净光合速率的大小，叶绿素a/b比值也能在一定程度上反映光合速率，作物具有较高的光合速率，就可能有较高的产量，叶绿素的含量与作物的产量呈正相关。另外，叶绿素的荧光性质与叶绿素含量密切相关，叶绿素的荧光参数反映植物光合机构内部变化和生理调节能力，可用于表征植物对光能的利用效率。

该研究结果表明，以丙酮和无水乙醇混合溶剂，可成功提取银杏叶叶绿素，采用分光光度法测定和Amon公式计算，得到银杏叶中叶绿素a和叶绿素b的含量。在不同月份中，7月份银杏叶中叶绿素的含量最高，但叶绿素a/b的比值却最低，而4月份银杏叶中叶绿素的含量较低和叶绿素a/b的比值最高，这可能与银杏叶发育成熟程度的变化有关。银杏叶叶绿素具有2个特征荧光发射峰，分别位于691和718 nm处，它是良好的红色荧光材料。银杏叶叶绿素在2个发射峰处的磷光寿命分别为8.61和8.21 μs，它具有良好的磷光性质。

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