罗氏沼虾TLRs基因表达差异分析

刘伟利　刘红　丁福江　戴习林

摘要：【目的】探究罗氏沼虾Toll样受体（TLRs）基因（MrToll1、MrToll2和MrToll3）在不同组织中及感染溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）后不同时间鳃组织的表达量差异变化，为揭示罗氏沼虾TLRs在应对病害等免疫方面的表现和作用机理提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量RT-PCR分别检测MrToll1、MrToll2和MrToll3基因在罗氏沼虾肌肉、鳃、肝胰腺、心脏、胃、肠、血淋巴、神经节、眼柄等不同组织中的相对表达量，并以同样方法检测罗氏沼虾感染溶藻弧菌后TLRs基因的相对表达量变化情况。【结果】罗氏沼虾MrToll1、MrToll2和MrToll3基因在各组织中广泛表达，但存在组织表达差异性。MrToll1和MrToll2基因在鳃组织中的相对表达量最高，分别是在肝胰腺中相对表达量的19.26和20.03倍；MrToll3基因在神经节中的相对表达量最高，是在肝胰腺中的10.13倍。感染溶藻弧菌悬液后，羅氏沼虾死亡率随时间的推移不断升高，至注射感染72 h时死亡率达峰值（64%），随后不再出现死亡。感染溶藻弧菌后罗氏沼虾MrToll1基因表达量呈先升高后下降的变化趋势，注射感染后24 h的表达量达峰值；Mrtoll2基因表达量呈下降—升高—下降—升高的波动变化趋势，注射感染后24 h的表达量达峰值；MrToll3基因表达量急剧下降，且维持在较低水平。【结论】罗氏沼虾MrToll1基因是鳃组织抵御细菌感染的主要应答基因，MrToll2基因可能参与鳃组织的其他免疫活动，MrToll3基因的调控机制尚未清晰。

关键词：罗氏沼虾；Toll样受体（TLRs）；表达差异；溶藻弧菌；实时荧光定量PCR

中图分类号： S945.41 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0721-07

Abstract：【Objective】By analyzing the differential expressions of three Toll-like receptor（TLRs） genes including MrToll1， MrToll2， MrToll3 in different tissues of Macrobrachium rosenbergii and expression difference of gill at different times after infection with Vibrio alginolyticus， the present study provided reference for revealing immune function of M. rosenbergii TLRs in fighting diseases. 【Method】Real-time fluorescence quantitative RT-PCR was applied to detect relative expressions of MrToll1， MrToll2 and MrToll3 in muscle， gill， hepatopancreas， heart， stomach， gut， hemolymph， nerve ganglion， and eyestalk. The same method was also used to test the expression changes of TLRs gene after infected by V. alginolyticus. 【Result】MrToll1， MrToll2 and MrToll3 genes were expressed in all of the tested tissues and there also existed differential expressions. MrToll1 and MrToll2 genes highly expressed in gill among these tissues while the relative expression of MrToll1 and MrToll2 in gill were as much as 19.26 times and 20.03 times as those in hepatopancreases respectively. The expression of MrToll3 gene was the highest in nerve ganglions， which was as 10.13 times as that in hepatopancreases. After infected by V. Alginolyticus， mortality rate of M. rosenbergii increased as time spent， and reached the peak at 72 post infection（64%）. After 72 h post infection， no more mortality occurred. After infection with V. alginolyticus， the expression of MrToll1 gene rose first and then decreased， and reached the peak 24 h post infection. The expression of MrToll2 went through a down-up-down-up variation， and reached the maximum 24 h post infection. The expression of MrToll3 gene decreased sharply and maintained at low level. 【Conclusion】MrToll1 gene is major response gene for gill resisting bacterial infection， MrToll2 gene may be involved in other immune activities of gill， and regulation mechanism of MrToll3 is unknown.

Key words： Macrobrachium rosenbergii； Toll-like receptor（TLRs）； differential expression； Vibrio alginolyticus； real-time fluorescence quantitative PCR

0 引言

【研究意义】虾类免疫机制较简单，主要依靠先天免疫机制中的低端免疫系统来实现免疫防御，包括体液免疫和细胞免疫应答。其中，体液免疫主要通过溶菌酶、凝集素酚氧化还原酶、细胞黏附分子、抗菌肽和其他活性成分有效诱导先天免疫应答，细胞免疫则由不同类型的血细胞通过凋亡、包裹、吞噬作用等一系列反应来完成（Rowley and Powell，2007）。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是目前发现能识别仅表达在病原微生物上的高度保守结构基序——病原相关分子模式的一组蛋白（杨敏等，2004）。TLRs在识别入侵病原微生物的过程中发挥重要作用，受病原相关分子刺激而启动信号级联反应，促使细胞因子产生及协同刺激因子表达，在天然免疫和获得性免疫中起到桥梁作用。【前人研究进展】人类TLRs的结构、分布、功能及其与疾病的关系已有深入研究（唐深和冷静，2004），但有关虾类TLRs的研究起步相对较晚，直到2007年Yang等才报道克隆获得凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）Toll受体基因。随后，多种对虾Toll受体基因被发现（Ao et al.，2008；Mekata et al.，2008）。目前，针对甲壳动物TLRs的研究主要集中在对虾方面，已从虾类中克隆获得11个TLRs基因。Wang等（2012）从凡纳滨对虾克隆获得LvToll1、LvToll2和LvToll3等3个TLRs基因；第4个TLRs基因在斑节对虾（Penaeus monodon）鳃的cDNA文库中检测获得，且证实不存在组织表达特异性（Arts et al.，2007）。在中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）及日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）体内分别发现了1个TLRs基因，从斑节对虾中还克隆获得1个比第一条序列还长的TLRs基因（Assavalapsakul and Panyim，2012）。本课题组前期从罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）克隆获得3个TLRs基因（苏建等，2014）。至今，已报道的几种海洋无脊椎动物TLRs基因均呈非组织特异性表达，如中国鲎（Tachypleus tridentatus）HsToll基因（Inamori et al.，2004）、凡纳滨对虾LvToll基因（Arts et al.，2007）、栉孔扇贝（Chlamys farreri）CfToll-1基因（Qiu et al.，2007）、中国明虾FcToll基因（Yang et al.，2008）和日本囊对虾MjToll基因（Mekata et al.，2008）。【本研究切入点】TLRs可识别各种不同的疾病相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），进而激发先天免疫机制分泌有关炎症因子、抗微生物蛋白等以阻止病原微生物入侵，而且可对抗原呈递细胞发出预告，开启先天具有的免疫机制，但至今有关罗氏沼虾TLRs免疫机理的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过对罗氏沼虾不同组织及感染溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）后TLRs基因表达量的差异变化进行分析，为揭示罗氏沼虾TLRs在应对病害等免疫方面的表现和作用机理提供参考依据。

1 材料與方法

1. 1 试验材料

罗氏沼虾由上海申漕特种水产开发公司亲虾塘提供，选取规格统一、体表无损伤的亲虾，测量体长和体重，试验前在水泥池里暂养7 d。溶藻弧菌由上海海洋大学海洋生物实验室保存，从罗氏沼虾养殖水体中分离鉴定获得。试验用水槽为蓝色塑料箱，其规格为70 cm×50 cm×40 cm（长×宽×深），使用前洗净并用5%高锰酸钾溶液浸泡6 h后润洗备用。RNAiso Plus、PrimescriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser、pMD19-T载体、DH5α感受态细胞等购自宝生物工程（大连）有限公司，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱形）、DEPC、氨苄青霉素等购自生工生物工程（上海）股份有限公司。LBS液体培养基（1 L）：50 mL Tris（1 mol/L，pH 7.5），10 g胰蛋白胨，5 g母膏，20 g NaCl，加蒸馏水至1 L。主要仪器设备：台式冷冻离心机、微量分光光度计、凝胶成像仪、核酸蛋白检测仪、微量移液器、温度梯度PCR仪和罗氏荧光定量PCR仪LightCycler 480。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 总RNA提取 罗氏沼虾各组织用液氮速冻后研磨成粉末状，用RNAiso Plus试剂提取各组织RNA。提取的RNA以DEPC-H2O溶解后用紫外可见分光光度计进行定量测量，再用1.2%琼脂糖变性胶检测RNA完整性。确定RNA无降解后分装并置于-80 ℃冰箱保存待用。

1. 2. 2 1.2%甲醛变性胶电泳 以3% H2O2浸泡电泳槽，然后用DEPC-H2O润洗；配制甲醛变性胶及上样缓冲液，各组织RNA的添加量均为1.0 μg，制备25.0 μL上样缓冲液体积，包括1.0 μg总RNA、2.5 μL 10×Mops、7.5 μL甲酰胺、2.7 μL甲醛、1.0 μL 6×Lodding Buffer和1.0 μL EB，向该配比溶液加DEPC-H2O至总体积25.0 μL。65 ℃变性10 min后立即冰上冷却3 min。称取0.3 g琼脂糖，加入22.0 mL DEPC-H2O，加热至完全溶解，当温度降至55 ℃左右时加入1.5 mL 10×Mops和2.5 mL甲醛，制成电泳凝胶。电压为5 V/cm，电泳缓冲液为1× Mops，电泳90 min，在凝胶成像仪上拍照并记录。

1. 2. 3 cDNA合成 完整无降解的RNA用cDNA第一链合成试剂盒（PrimescriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser）中的RNase-free DNase I消化各组织的总RNA，消化步骤为5×gDNA Erase Buffer 2.0 μL， gDNA Erase 1.0 μL，各组织总RNA 1.0 μg，加RNase-free ddH2O补足至10.0 μL，42 ℃消化2 min。以已消化好的鳃组织RNA为模板进行反转录合成cDNA，具体步骤：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。

1. 2. 4 引物设计与扩增 根据GenBank已发表的罗氏沼虾MrToll1（KJ188410.1）、MrToll2（KJ188411.1）、MrToll3（KJ188412.1）和Mr18s（GQ131934.1）序列，在其保守区域分别设计引物（表1），并用Oligo 6.0分析及评价其特异性。

采用设计的特异引物进行PCR扩增，DNA模板为反转录获得的cDNA，反应体系20.0 μL：2×Master Mix 10.0 μL，正、反向引物各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8.6 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸3 min。PCR产物用1.5%瓊脂糖凝胶电泳在80 mA条件下进行检测。

1. 2. 5 扩增产物测序 取25.0 μL PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NBCI中进行BLAST比对分析。

1. 2. 6 实时荧光定量PCR检测及数据处理 实时荧光定量PCR反应体系20.0 μL，包括SYBR Premix Fx Taq 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL（100 ng），ddH2O 6.4 μL。反应程序：95 ℃ 5 s（4.4 ℃/s）；95 ℃ 5 s（4.4 ℃/s），60 ℃ 30 s（2.2 ℃/s），进行40个循环。运用反应熔解曲线检测其特异性，每尾虾的每个组织设3个重复孔和一个内参18S rRNA对照。罗氏沼虾TLRs基因相对表达量采用Livak和Schmittgen（2001）建立的2-ΔΔCt进行计算，并以SPSS 17.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比较。

1. 2. 7 溶藻弧菌对罗氏沼虾感染预试验 参考Chu等（2011）的方法，将溶藻弧菌转接至LBS液体培养基中，在28 ℃下摇床（150 r/min）培养24 h，利用细菌平板计数法将其稀释至1.0×1010 CFU/mL。经10000 r/min离心10 min，弃上清液，PBS洗涤重悬，按照同样方法进行3次离心。梯度稀释溶藻弧菌悬浮液至1.0×108、1.0×107、1.0×106和1.0×105 CFU/mL，4 ℃保存备用。以0.85%无菌生理盐水为对照组，在罗氏沼虾的第二附肢基部注射溶藻弧菌（4个梯度浓度），注射剂量10 μL/g，每组10尾虾，分别于注射攻毒后1、6、12、24、48、72和96 h观察罗氏沼虾死亡情况，参考顾兵等（2009）的Bliss加权法计算出感染正式试验所需的最佳菌悬液浓度。饲养管理：每天喂食2次，每天投饵量为体重的3%，每隔3 d换水1次，每次换水量为1/3～1/2，水温保持在25～30 ℃，溶解氧保持在5 mg/L以上。

1. 2. 8 溶藻弧菌感染试验及样品取样 随机挑选300尾罗氏沼虾分成3组（感染组、对照组和空白组），50尾虾/组，每组设2个平行，一个平行为检测取样，另一个平行为观察试验。感染组：于第二附肢基部注射1.0×107 CFU/mL溶藻弧菌，注射剂量10 μL/g；对照组：于第二附肢基部注射等体积的0.85%无菌生理盐水；空白组：不进行任何处理。分别于注射攻毒后1、6、12、24、48、72和96 h观察罗氏沼虾死亡情况，然后从每组随机抽取5尾体表无损伤的罗氏沼虾，取鳃组织用于实时荧光定量PCR检测。

2 结果与分析

2. 1 总RNA完整性检测结果

吸取1.0 μL不同组织RNA，使用微量紫外分光光度计进行检测，发现罗氏沼虾各组织总RNA的A260/A280均在1.8～2.1；用1.2%琼脂糖变性胶检测其完整性，电泳结果如图1所示，可清楚观察到各组织的总RNA条带，且边界清晰，说明总RNA完整性良好且纯度较高。

2. 2 罗氏沼虾TLRs基因的RT-PCR扩增结果

利用引物MrToll1-F/MrToll1-R、MrToll2-F/MrToll2-R、MrToll3-F/MrToll3-R、Mr18S-F/Mr18SR对罗氏沼虾各组织总RNA进行RT-PCR扩增，扩增产物电泳结果如图2所示。4对引物均能扩增出单一清晰的目的条带，且产物大小与预期结果一致。各扩增产物测序结果经BLAST比对分析，发现其序列比对结果完全对应各自的TLRs基因部分序列及罗氏沼虾的18S rRNA部分基因序列。

2. 3 罗氏沼虾TLRs基因在不同组织中表达量的比较

通过实时荧光定量PCR检测罗氏沼虾3种TLRs基因在肌肉、肝胰腺、眼柄、心脏、胃、鳃、神经节、血淋巴和肠中的相对表达量（将TLRs基因在肝胰腺中的相对表达量设为1.0），结果显示，3种TLRs基因在各组织中均有表达，但存在组织表达差异性（图3）。其中，MrToll1基因在血淋巴、胃和鳃中的相对表达量较高，其次是肠、神经节、眼柄、心脏和肌肉，在肝胰腺中的相对表达量较低，其在鳃组织中的相对表达量是肝胰腺中的19.26倍；MrToll2基因在鳃组织中的相对表达量最高，其次是神经节、肠、胃、心脏、血淋巴和眼柄，在肝胰腺和肌肉中的相对表达量较低，其在鳃组织中的相对表达量是在肝胰腺中的20.03倍；MrToll3基因在神经节和心脏中的相对表达量最高，其次是鳃，在肝胰腺、血淋巴、眼柄、胃和肌肉中的相对表达量较低，其在心脏和神经节中的表达量分别是在肝胰腺中的10.13和8.88倍。

2. 4 罗氏沼虾感染溶藻弧菌后的死亡率差异

预试验结果表明，溶藻弧菌感染罗氏沼虾的最佳菌悬液浓度为1.0×107 CFU/mL。由表2可知，注射溶藻弧菌悬液后，感染组罗氏沼虾死亡率随时间的推移不断升高，至注射感染72 h时死亡率达峰值（64%），随后不再出現死亡；而对照组和空白组均未出现罗氏沼虾死亡现象。此外，感染组罗氏沼虾表现较异常：行动迟缓，反应迟钝，摄食量明显减少，会趴在遮蔽处静伏，但感染72 h后受感染的罗氏沼虾行动力增强，摄食量增加。对照组和空白组罗氏沼虾的行为及摄食与正常虾相似。

2. 5 罗氏沼虾感染溶藻弧菌后TLRs基因相对表达量的变化

从图4可看出，感染溶藻弧菌后罗氏沼虾3种TLRs基因相对表达量随时间推移表现出不同的变化趋势。感染溶藻弧菌后，对照组MrToll1基因相对表达量出现忽高忽低的波动，与感染前（0 h）相比，在感染后1、12、24和48 h均出现显著差异（P<0.05，下同）。感染组MrToll1基因相对表达量呈先升高后下降的变化趋势，至感染后24 h的相对表达量达峰值，是感染前（0 h）相对表达量的4.97倍，感染后6、12、24和48 h的相对表达量较感染前均达显著差异水平，且显著高于同一时间对照组的相对表达量。空白组MrToll1基因在不同时间点（除感染后12 h外）的相对表达量与感染前相比差异均不显著（P>0.05，下同）。

感染溶藻弧菌后，对照组中MrToll2基因相对表达量出现忽高忽低的波动，与感染前（0 h）相比仅在感染后72 h出现显著差异。感染组MrToll2基因相对表达量呈下降—升高—下降—升高的波动变化趋势，至感染后24 h的相对表达量达峰值，是感染前（0 h）相对表达量的1.32倍，感染后1、6、48、72和96 h的相对表达量较感染前（0 h）均达显著差异水平，且除感染后24 h外，其他时间点感染组的表达量均显著低于对照组。空白组MrToll2基因的相对表达量波动较小，与感染前（0 h）相比未达显著差异水平。

在感染溶藻弧菌初期（1～12 h），罗氏沼虾鳃组织中MrToll3基因相对表达量在感染组和对照组整体上呈降低趋势，且均维持在较低水平。其中，感染组MrToll3基因相对表达量在感染后1～72 h显著低于空白组。感染组在感染后12 h达最低值，其相对表达量仅为感染前（0 h）的13%。由此推测，MrToll3基因与刺激相关，如注射等物理刺激均能引起其表达量发生较大变化。

3 讨论

罗氏沼虾食性广、生长快、肉质鲜嫩，是目前全球养殖产量最高的三大虾种之一（刘波等，2010）。随着水产养殖业的迅速发展，养殖水域环境不断恶化，虾类也衍生出越来越多的疾病（徐海圣，2003；Wang et al.，2007），包括一些能给水产养殖业带来巨大危害的传染性疾病。其中由溶藻弧菌引起的弧菌病因发病率高、传播速度快，已成为虾类养殖的主要传染性疾病，给世界虾类养殖业带来巨大经济损失（Lee et al.，1996；Selvin and Lipton，2003）。因此，了解虾类的免疫机制，加强其免疫机能研究，是防控虾类疾病流行传播的有效途径。本研究通过分析罗氏沼虾TLRs基因组织表达差异研究其应对病害等免疫方面的表现和作用机理，经实时荧光定量PCR检测发现罗氏沼虾MrToll1和MrToll2基因在鳃组织中的相对表达量最高，在肝胰腺组织中的相对表达量最低，与凡纳滨对虾LvToll2基因（Yang et al.，2007；黄旭雄等，2012）、中国明对虾FcToll基因（Yang et al.，2008）的组织相对表达情况基本一致。

血淋巴细胞不仅是虾类免疫系统中最重要的组成成分，还是免疫功能（包括识别、吞噬、黑化和细胞间信息传递）的主要完成者（Johansson et al.，2000）。多数非细胞类免疫因子通过其他途径或多或少地与血淋巴细胞产生联系。虾类的鳃部与外界环境直接接触，其细胞参与多种生理功能活动（如呼吸、渗透压调节和解毒作用），对环境中生物或非生物因子的变化十分敏感，当给虾类注射异物颗粒时，其血淋巴细胞产生的免疫反应——包囊作用主要在鳃部进行（Burgents et al.，2005）。脂多糖因子在中国明对虾的鳃部、肠道和血淋巴细胞中表达量很高，而在肌肉、肝胰腺和卵巢组织中表达量较低（Liu et al.，2005）。这些都说明在抵抗病原微生物入侵过程中鳃组织和淋巴细胞均发挥了至关重要的作用（Tauszig et al.，2000；Gay and Gangloff，2007；O'Neill and Bowie，2007），因此推测MrToll1和MrToll2基因与抵抗病原微生物相关。本研究结果表明，罗氏沼虾MrToll1和MrToll2基因在鳃组织中的相对表达量最高，进一步佐证MrToll1和MrToll2基因在罗氏沼虾中也应该是与抵抗病原微生物相关的基因。

Yang等（2008）以灭活的鳗弧菌（Vibrioan guillarum）感染中国明对虾，结果发现TLRs基因的表达量在注射后5 h内显著下降，但从第8 h时开始显著上调，直至注射后23 h达峰值。Han-Ching Wang等（2010）以8.3×103 CFU/g哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）感染凡纳滨对虾，发现TLRs基因表达量于注射后24 h达峰值，为对照组的15.17倍。本研究结果表明，罗氏沼虾鳃组织中TLRs基因的相对表达量在感染早期呈下降趋势，之后逐渐上升，至感染后24 h达峰值，与上述研究结果相似。说明TLRs参与了对虾抵抗革兰氏阴性菌的免疫反应。凡纳滨对虾在注射溶藻弧菌（1×107 CFU/mL）后鳃组织中LvToll1基因表达量在注射后12和24 h均显著高于未感染组（Wang et al.，2012）；日本囊对虾经1×105 CFU/mL黑美人弧菌（V. nigripulchritudo）感染后，TLRs基因表达量在注射后12和24 h均显著上调（Fall et al.，2010）。本研究中，溶藻弧菌感染组罗氏沼虾MrToll1基因相对表达量在感染后1～48 h显著上调，且在第24 h达峰值，而对照组罗氏沼虾MrToll1基因相对表达量在各时间无显著差异（除24 h显著下调外），表明MrToll1直接参与了抵御溶藻弧菌入侵的信号通路，且很可能呈正相关。MrToll2基因在感染后呈先下降后上升的变化趋势，除第24 h外，其他各时间点的相对表达量均低于对照组和空白组，说明溶藻弧菌入侵后在一定程度上能抑制MrToll2基因表达，与中国明对虾的调节机制相似。MrToll3基因的调控机制尚未清晰，其与免疫调控是否存在关联尚需进一步研究证实。

4 结论

罗氏沼虾MrToll1基因是鳃组织抵御细菌感染的主要应答基因，MrToll2基因可能参与鳃组织的其他免疫活动，MrToll3基因的调控机制尚未清晰。

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（責任编辑 兰宗宝）