不同烤烟套作模式对烤烟根际土壤细菌群落特征及烤烟产质量的影响

韦俊　杨焕文　徐照丽　邓小鹏　王戈　白羽祥　吕世保　谭小兵

摘要：【目的】探討云南不同烤烟套作模式对烤烟根际土壤细菌群落特征及烤烟产质量的影响，为优化当地烤烟种植模式提供科学依据。【方法】采用单因素随机区组试验，设烤烟套种白菜（T1）、烤烟套种结球甘蓝（T2）和烤烟套种豌豆（T3）3个处理，以烤烟单作为对照（CK），采用16S rRNA测序技术分析不同套作模式烤烟根际土壤细菌群落结构及多样性差异，同时进行土壤优势细菌与土壤理化性状的相关性分析及不同处理的烤烟产质量分析。【结果】16S rRNA测序结果表明，套作处理整体可提高烤烟根际土壤细菌多样性指数，Shannon指数排序为T3>T2>T1>CK，Simpson指数排序为T3=T2>T1>CK，Chao1和ACE指数排序为T3>T2>CK>T1。各处理烤烟根际土壤细菌主要分布在10个菌门，其中变形菌门（Proteobacteria）的丰度最高，占各样本总有效序列的50%以上。CK处理根际土壤中副球菌属（Paracocccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、马赛菌属（Massilia）、Psychrobacter属、短波单胞菌属（Brevundimonas）和产卟啉杆菌属（Porphyrobacter）丰度较套作处理显著提高（P<0.05，下同），而鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Haliangium属丰度显著降低；烤烟套作处理显著降低了烤烟根际土壤pH，同时提高了烤烟根际土壤的主要养分含量。相关性分析结果表明，CK处理土壤中丰度较高的假单胞菌属（Pseudomonas）与土壤总有机碳含量呈显著负相关，丰度较低的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Haliangium属与土壤总有机碳含量呈显著正相关。不同套作处理可不同程度地提高烤烟产质量，产值、产量、均价和上等烟比例排序均为T3>T2>T1>CK，以T3处理与优质烟叶标准最接近，化学成分最协调。【结论】烤烟套种白菜、结球甘蓝和豌豆较烤烟单作可明显提高烤烟根际细菌多样性，不同程度地降低土壤中潜在致病菌丰度，提高烤烟产质量，其中以套种豌豆的效果最佳。

关键词： 烤烟；套作；高通量测序；细菌；多样性；产质量

中图分类号： S572；S154.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0601-08

Abstract：【Objective】Effects of different intercropping patterns on rhizosphere soil bacteria colony characteristics and flue-cured tobacco yield and quality were studied in order to provide reference for improving local tobacco planting pattern. 【Method】Single-factor randomized block experiment was adopted and tobacco-Chinese cabbage intercropping（T1）， toba-

cco-common head cabbage intercropping（T2）， tobacco-pea intercropping（T3） were set， and tobacco single planting was taken as control（CK）. Rhizosphere bacteria colony characteristics and diversity index were analyzed by 16S rRNA sequen-

cing. Correlation between dominant bacteria and soil physical and chemical properties， yield and quality of flue-cured tobacco in different treatments were also studied. 【Result】16S rRNA sequencing showed that intercropping could increase diversity indexes of rhizosphere soil bacteria. Shannon index ranking was as follows：T3>T2>T1>CK， Simpson index ranking was： T3=T2>T1>CK， Chaol index and ACE index ranking were the same： T3>T2>CK>T1. Rhizosphere soil bacteria in different treatments fell into ten phyla， and abundance of Proteobacteria was the highest and consisted of over 50% total effective sequences. In CK， abundance of Paracocccus，Pseudomonas，Massilia，Psychrobacter，Brevundimonas and Porphyrobacter in rhizosphere soil significantly increased compared with those in intercropping treatments（P<0.05， the same below）， but abundance of Sphingomonas and Haliangium significantly decreased. Intercropping treatments significantly decreased pH value but increased major nutrient contents of rhizosphere soil. Correlation analysis showed that：in CK， there was significant negative correlation between high-abundance Pseudomonas and total soil organic carbon content， and significant positive correlation between low-abundance Sphingomonas and Haliangium and soil total organic carbon content. Different intercropping treatments could increase tobacco quality to various extents， and the ranks of output value， yield， average price and proportion of first-class tobacco were the same： T3>T2>T1>CK. The tobacco quality in T3 was the closest to high-quality tobacco standard with the most balanced chemical components. 【Conclusion】Tobacco intercropping Chinese cabbage， common head cabbage and pea can obviously increase diversity of rhizosphere soil bacteria， lower abundance of potential pathogenic bacteria in soil to certain extent， and improve tobacco quality. Tobacco-pea intercropping has the optimal effects.

Key words： flue-cured tobacco； intercropping； high throughput sequencing； bacteria； diversity； yield and quality

0 引言

【研究意义】微生物作为土壤的重要组成成分与土壤营养转化、土壤肥力及土壤质量密切相关（阳显斌等，2016）。土壤微生物群落结构和多样性在土壤有机质分解、养分循环利用及维持生态系统的稳定性方 面发挥着重要作用（贾志红等，2004）。烤烟是云南重要的经济作物之一，但随着种烟面积的逐年增加，近年来粮烟争地矛盾日益凸显，加之烟区连作现象普遍，给植烟土壤的健康及烟叶可持续生产带来了巨大威胁。间套种栽培模式在我国有着悠久历史（吴存浩，1996），其中适宜的套作模式对缓解用地矛盾、增加土地产出、降低病虫害、维持土壤生态系统稳定性及促进土地可持续利用均具有重要作用。烟/白菜、烟/结球甘蓝和烟/豌豆是云南烟区烤烟生产中常见的套作搭配模式。因此，研究这3种套作模式对烟草根际土壤微生物数量和多样性的影响，进一步探明不同套作模式烤烟根际微生物结构差异及其与土壤理化性质的相关性，可为今后优化烤烟种植模式、促进烤烟产质量提高提供参考。【前人研究进展】近年来，套作模式的研究正在从宏观的作物产质量和病虫害防治向微观的土壤微生态和土壤成分互作方面延伸。套作植物间不仅竞争着地上、地下部的生长空间，还通过根系向土壤释放次生代谢物质来影响土壤微生物群落结构，从而间接影响作物的生长发育和养分吸收。套作可以提高土壤微生物群落多样性，微生物群落多样性又与作物生长发育息息相关（Zuo，2004）。李秋红等（2010）研究了黄瓜套作毛葱和蒜对其根际土壤细菌群落结构多样性的影响，结果表明，套作改变了黄瓜根际土壤细菌群落结构的多样性和优势菌群结构，并且可提高黄瓜产量。徐强等（2013）研究发现，线辣椒套种玉米可显著提高线辣椒根际土壤微生物群落的种间相遇几率和Shannon、McIntosh多样性指数，且线辣椒的根际土壤微生物多样性指数分别与其生物学产量呈显著或极显著正相关。涂勇等（2015）研究指出，烤烟—大豆带状套作可显著增加作物根际土壤的细菌、放线菌数量，减少真菌数量，同时可提高与土壤氮素代谢相关的氨化细菌、硝酸细菌、亚硝酸细菌、自生固氮菌等功能性微生物数量，能降低烤烟主要土传病害的发生。阳显斌等（2016）研究指出，烟/蒜套作可提高烤烟根际土壤细菌和放线菌数量，降低土壤真菌数量，在烤烟生长发育的中后期显著提高烤烟根际土壤解钾菌和解磷菌含量，从而提高根际可吸收养分，有效改善土壤根际微生态。张黎杰等（2016）研究表明，西瓜—草菇—辣椒轮作模式可增加土壤中细菌和放线菌数量，同时降低有害病原真菌数量，改善土壤理化性质和恢复土壤微生物种群数量，有利于消除土壤连作障碍的影响。【本研究切入点】目前，关于烤烟套作白菜、豌豆和结球甘蓝对烤烟根际细菌微生物群落的影响及其与土壤理化性质相关性的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】基于Illumina MiSeq测序平台（Luo et al.，2012），通过构建16S rDNA基因文库（Youssef et al.，2009；Caporaso et al.，2011；Hess et al.，2011），从细菌丰度差异和群落多样性方面分析烤烟套作白菜、豌豆和结球甘蓝的烤烟根际微生物群落优劣及其与土壤理化性质的关系，旨在揭示这3种烤烟套作模式对烤烟根际土壤质量变化影响的内部生态学机理，为优化烤烟种植模式提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用烤烟品种为当地主栽品种K326，采用漂浮育苗方式育苗，烤烟种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供；白菜、结球甘蓝和豌豆种子由中农种子中心提供。

1. 2 试验方法

大田试验于2015年在云南省楚雄州姚安县进行。采用单因素随机区组试验，设烤烟套种白菜（T1）、烤烟套种结球甘蓝（T2）和烤烟套种豌豆（T3）3个处理，以烤烟单作为对照（CK），每處理重复3次。烟苗于4月20日统一移栽，以纯氮120 kg/ha为施肥标准，种植密度16500株/ha，参考优质烤烟栽培技术进行田间管理。套作作物白菜、结球甘蓝、豌豆于8月5日（烤烟生长的中后期）在烟墒中下部移栽，10月20日开始采收，12月20日采收完毕，田间管理按作物优产田栽培技术统一进行。

1. 3 测定项目及方法

1. 3. 1 样品采集

1. 3. 1. 1 烟叶样品 采收各处理上部成熟烟叶进行烘烤，烤后分等级称重，选取上部叶片（等级均为上桔二）粉碎过筛常温保存，用于烟叶化学成分分析。

1. 3. 1. 2 土壤样品 烤烟和套作作物收获后用螺旋取土钻垂直钻取烤烟根际0～20 cm土壤，将土壤分为两份，一份避光风干至恒重后用于土壤理化性质分析，另一份置于-80 ℃冰箱存储，用于细菌16S rRNA测序。

1. 3. 2 土壤细菌16S rRNA测序 应用CTAB法提取土壤样本细菌基因组DNA，用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度与纯度，将样品放入离心管中，无菌水稀释样品至样品基因组DNA浓度为1 ng/μl。以提取的DNA为模板，根据细菌测序区域的选择515F（16S V4区引物）鉴定细菌多样性。使用带Barcode的特异性引物（New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）和高效保真酶进行PCR。应用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物DNA的完整性、纯度和片段大小，依据PCR产物浓度等量混合样品，充分混匀后使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用Qiagen公司提供的胶回收试剂盒对目的条带产物进行回收。

1. 3. 3 土壤细菌基因组DNA信息分析

1. 3. 3. 1 测序数据处理 首先从Illumina MiSeq测序平台下机数据中分离出样品数据，使用FLASH（Mago and Salzberg，2011）拼接截去Barcode和引物序列后的样品Reads，得到Raw Tags，Raw Tags經过滤处理（Bokulich et al.，2012）后得到Clean Tags。然后按照Tags质量控制流程（Caporaso et al.，2010）通过数据库Gold Database与UCHIME Algorithm（Edgar et al.，2011）比对后将Clean Tags进行检测和去除嵌合体序列（Haas et al.，2011）处理，最终得到Effective Tags。

1. 3. 3. 2 OTU聚类和物种注释 利用UPARSE对各处理土壤细菌样品的Effective Tags进行聚类分析处理，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，选取OTUs的代表性序列进行物种注释，用Mothur方法结合SILVA（Altschul et al.，1990）SSUrRNA数据库（Kljalg et al.，2013）进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1.0），获得分类学信息并分别在界、门、纲、目、科、属、种各个分类水平统计样本的群落组成。使用PyNAST（Yilmaz et al.，2014）结合Green Gene数据库中的Core Set数据信息进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后以数据量最少的样本为标准进行均一化处理。

1. 3. 3. 3 样品多样性分析 使用Qiime 1.7.0计算各处理样本的Observed-species、Goods-coverage、Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数，其中Goods-coverage指数用于分析测序深度，Shannon和Simpson指数用于分析菌群多样性，Chao和ACE指数用于分析菌群丰富度。

1. 3. 4 土壤理化性质测定 参照Liu（1996）测定土壤pH及有机质、全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷和速效钾含量。

1. 3. 5 烟叶化学成分测定 依照YC/T 159162- 2002采用连续流动法测定烟叶的总糖、还原糖、总氮、烟碱和氯含量，依照YC/T 217-2007应用连续流动法测定烟叶钾含量。

1. 4 统计分析

应用Exce1 2007和SPSS 19.0进行数据处理和统计分析；利用UPARSE和Mothur方法结合SILVASSUrRNA数据库进行物种注释分析；使用PyNAST结合GreenGene数据库中的Core Set数据信息进行快速多序列比对。

2 结果与分析

2. 1 不同套作模式对烤烟根际土壤细菌α多样性指数的影响

由表1可知，烤烟根区的细菌OTUs数为2759.33～ 3246.00个，其中T3处理最高，与其他处理间差异显著（P<0.05，下同），T1、T2和CK处理间OTUs数差异未达显著水平（P>0.05，下同）。各处理样本覆盖率较高，为96.2%～97.1%，说明构建的文库包含样品中大部分细菌种类，能较好地反映土壤细菌群落结构。不同套作模式对土壤α多样性指数的影响存在差异，Shannon指数排序为T3>T2>T1>CK，其中T3与T2处理差异不显著，但显著高于T1和CK处理；Simpson指数大小排序为T3=T2>T1>CK，3个套作处理差异不显著，但均显著高于CK，说明烤烟套作处理较烤烟单作可提高其根际细菌的多样性指数，其中套种豌豆的提高幅度最大。Chao1和ACE指数排序均为T3>T2>CK>T1，说明套种结球甘蓝和豌豆有利于提高烤烟根际土壤细菌丰富度指数，套种白菜则降低了烤烟根际土壤细菌丰富度指数，但套种结球甘蓝和白菜与烤烟单作间细菌丰富度指数差异不显著。

2. 2 不同套作模式对烤烟根际土壤细菌丰度的影响

由图1可看出，各处理烤烟根际土壤细菌主要分布在10个菌门，包括变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、Saccharibacteria门、疣微门（Verrucomicrobia）和浮霉菌门（Planctomycetes）；其中变形菌门的丰度最高，占各样本总有效序列的50%以上。

对样本丰度前32的菌属进行方差分析，结果（表2）发现，不同套作处理对烤烟根际土壤细菌丰度影响差异明显。CK的副球菌属（Paracocccus）、马赛菌属（Massilia）、Psychrobacter属、短波单胞菌属（Brevundimonas）和产卟啉杆菌属（Porphyrobacter）丰度显著高于3个套作处理；假单胞菌属（Pseudomonas）丰度最高，显著高于T3处理；鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Haliangium属显著低于3个套作处理；鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）丰度与其他处理差异不显著；芽孢杆菌属（Bacillus）丰度低于3个套作处理，与T1处理差异显著；新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）和溶杆菌属（Lysobacter）丰度均低于T1处理，但与T2和T3处理差异不显著。

2. 3 不同套作处理对烤烟根际土壤理化性质的影响

由表3可知，烤烟套作处理显著降低了烤烟根际土壤pH，说明套种3种作物有效改善了土壤pH，使其更接近于种植烤烟的适宜pH范围（5.5～6.5），其中以T3处理的改善效果最好；同时，烤烟套种处理较CK可提高烤烟根区土壤的总有机碳、全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷和速效钾含量，其中3个套种处理的全氮、速效氮和速效钾含量均显著高于CK。

2. 4 不同套作处理烤烟根际土壤细菌与土壤理化性质的相关性分析结果

将土壤理化性质与各样本丰度前32的菌属进行相关性分析，结果（表4）发现，土壤pH与寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）呈极显著正相关（P<0.01，下同）；总有机碳含量与鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Haliangium属呈显著正相关，与假单胞菌属（Pseudomonas）呈显著负相关；全氮含量与马赛菌属（Massilia）、Psychrobacter和Dyadobacter属呈显著负相关；全钾含量与Steroidobacter属和亚硝化螺菌属（Nitrosospira）呈显著正相关，与溶杆菌属（Lysobacter）呈极显著正相关；速效氮含量与Haliangium属呈显著正相关；速效钾含量与鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）呈显著正相关，与马赛菌属（Massilia）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）和产卟啉杆菌属（Porphyrobacter）呈显著负相关。

2. 5 不同套作模式对烤烟产质量的影响

2. 5. 1 经济性状 由表5可知，不同套作模式较单作可不同程度地提高烤烟产质量，产值、产量、均价和上等烟比例排序均为T3>T2>T1>CK，其中3个套作处理的产值和均价均显著高于CK，T3处理的产量和上等烟比例显著高于CK。

2. 5. 2 化学成分 中高海拔烟区优质烟叶以总氮含量1.5%～3.5%、烟碱1.5%～3.5%、总糖含量20.0%～28.0%、还原糖含量18.0%～25.0%、钾含量在2.0%以上、氯含量在1.0%以下、糖碱比10左右、氮碱比1左右、钾氯比4～10为宜（刘国顺，2003；胡荣海，2007）。由表6可知，T1和T3处理的总糖含量、CK和T3处理的还原糖含量符合优质烟叶标准，说明T3处理烟叶糖含量较适宜；各处理总氮、烟碱和氯含量均处于适宜范围内，钾含量均偏低，其中，T3处理的总氮、烟碱和钾含量最高，氯含量最低。各处理糖碱比均高于优质烟叶标准；氮碱比均小于1；各处理两糖差值均高于优质烟叶标准（2%～5%）；除T处理外，钾氯比均在适宜范围内。综合分析各项化学成分含量及相关比值，以T3处理与优质烟叶标准最接近，化学成分最协调。

3 讨论

3. 1 套作对烤烟根际土壤细菌群落及土壤理化性质的影响

套作处理可显著影响土壤微生物的数量及多样性。冯俊喜等（2011）研究发现，小麦/烤烟套作处理较烤烟单作可有效提高各取样时期的土壤微生物多样性指数。徐强等（2013）研究表明，线辣椒与玉米套作可提高线辣椒根际土壤微生物多样性指数，从而增强土壤微生物对单一碳源的利用能力。本研究发现，烤烟套种白菜、结球甘蓝和碗豆后，烤烟根际土壤细菌多样性指数均表现为T3>T2>T1>CK，且T3处理的Shannon指数及各套作处理的Simpson指数显著高于CK。说明烤烟套种处理较烤烟单作可不同程度地提高烤烟根际细菌多样性指数，与冯俊喜等（2011）和徐强等（2013）的研究结果相似。不同的套作搭配品种对微生物多样性的影响效果存在差异，本研究发现套种豌豆对烤烟根际细菌多样性指数的提高幅度最大，其原因可能是烤烟与豌豆套作，烤烟吸收土壤中的氮元素从而降低豌豆可吸收养分，氮胁迫条件下促使豌豆形成根瘤，合成氮素，固氮作用有效提高了土壤养分含量，进一步优化土壤质量，从而提高烤烟根际细菌多样性。

烤烟栽培模式不同程度地影响着土壤微生物数量，进而影响烤烟的养分吸收和病虫害的发生。如烟/蒜套作可提高根际土壤细菌含量，降低真菌数量，在烤烟生长的中后期显著提高根际土壤解钾菌和解磷菌含量（阳显斌等，2016），而烤烟单作使益生菌丰度降低，潜在的致病菌增加（石秋环等，2009）。本研究发现，相对于套作处理，烤烟单作的芽孢杆菌属丰度最低，假单胞菌丰度最高。芽孢杆菌可通过同化作用产生抑菌物质，进而有效抑制有害病原物的生长，具有很强的抗逆性能和抗菌作用（Elliott et al.，2001），而假单胞菌是能够寄生于植物的潜在病原菌（Fahlgren et al.，2011）。因此，烤烟套种3种作物不同程度地提高了益生菌的数量，降低了潜在病原菌的数量。然而，同种菌属中不同菌种在功能上并非完全一致，且同种菌种含量不同也可能导致作用效果不同，至于是何种细菌在一定丰度范围内影响作物生长有待进一步研究。

间套作模式可显著影响土壤的养分含量。如禾本科与豆科作物间作可提高豆科作物固氮能力，有效增加土壤的氮素营养（Cong et al.，2015）；花生/玉米（Inal et al.，2007）、青葱/黄瓜（Xiao et al.，2013）间作可显著提高土壤中的速效钾含量与植株中的钾含量；烟/蒜套作可提高成熟期烤烟下部叶和中部叶根际土壤的有效磷含量（唐彪等，2015）。本研究发现，烤烟套种白菜、结球甘蓝和豌豆均可降低烤烟根际土壤pH，使土壤酸碱度趋近适宜范围，同时提高烤烟根际的全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾及总有机碳的含量。经相关分析可知，土壤pH和主要养分含量与不同菌属丰度的相关性差异明显，其中潜在致病菌假单胞菌属与总有机碳含量呈显著负相关，而单作处理的假单胞菌属丰度均高于套作处理，可能是套作处理尤其是套种豌豆处理较烤烟单作的总养分含量较高的原因之一。

3. 2 套作对烤烟产质量的影响

套作处理可影響烤烟的产质量。付利波等（2005）研究表明，烟田套种白菜和马铃薯可使烟叶产值比烤烟单作处理提高13.73%～33.20%。时安东等（2011）研究表明，烤烟套种红薯、花生可使烟叶产量、产值连续6年显著高于烤烟单作，同时烟叶化学成分含量适中，比例更协调。本研究发现，不同套作模式较单作可不同程度地提高烤烟的产质量，产值、产量、均价和上等烟比例排序均为T3>T2>T1>CK，其中3个套作处理的产值和均价均显著高于CK，T3处理的产量和上等烟比例显著高于CK；同时综合分析各项化学成分含量及相关比值，以T3处理与优质烟叶标准最接近，化学成分最协调。说明套作处理可提高烟叶品质，尤其以套作豌豆对烤烟品质的改善作用最明显。

4 结论

本研究结果表明，烤烟套种白菜、结球甘蓝和豌豆较烤烟单作可明显提高烤烟根际细菌多样性，不同程度地降低土壤中潜在致病菌丰度，提高烤烟产质量，其中以套种豌豆的效果最佳。

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（責任编辑 王 晖）