华南常用籼稻亲本稻瘟病抗性评价及抗性基因鉴定

阎勇　马增凤　秦钢　陈远孟　秦媛媛　颜群　刘驰　张月雄　黄大辉

摘要：【目的】评价分析华南地区常用籼稻亲本稻瘟病抗性及抗性基因，为水稻稻瘟病抗性育种提供理论依据。【方法】利用人工接种鉴定对52份华南地区常用籼稻亲本进行稻瘟病抗性分析，同时利用分子标记检测稻株携带的抗性基因，分析亲本材料稻瘟病抗性与其所携带稻瘟病抗性基因间的关系。【结果】从52份适应华南生态条件的籼稻亲本材料中筛选获得4份广谱抗源（2份抗谱为100.0%，2份抗谱为92.9%）；常规稻较恢复系和保持系具有更高的稻瘟病抗性。ZA1、ZA9和ZB9生理小种较ZB1和ZB5生理小种表现出更强的致病力，具有较低的抗性频率。Pi-ta和Pi54基因的出现频率最高，均为0.42；其次是Pib基因，出现频率为0.37；Pi-km基因的出现频率较低，仅0.06；所有籼稻亲本材料中均未检测出Pi9基因。携带Pib+Pi54+Pi-km和Pi-ta+Pib+Pi54三基因稻株的抗性高于所有单基因或双基因稻株。【结论】华南常用籼稻亲本材料中存在着优良的稻瘟病广谱抗源，可利用这些抗源拓宽育种材料的遗传背景，培育抗病优良品种。多个抗性基因聚合能有效提高稻株对稻瘟病不同生理小种的抗性，在育种实践中应加强多基因聚合材料的创制和利用研究。

关键词： 籼稻；稻瘟病；抗性基因；广谱抗源；华南地区

中图分类号： S511.21 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0587-07

Abstract：【Objective】Blast resistance of main indica rice parent materials in South China and resistance genes were studied， in order to provide reference for blast resistant rice breeding. 【Method】Blast resistance of 52 indica rice parent materials in South China was analyzed by artificial inoculation. The resistance genes were detected by specific molecular markers. The relationship between blast resistance and resistance genes was analyzed. 【Result】Four materials（two with 100.0% resistant spectrum and two with 92.9% resistant spectrum） with broad spectrum resistance to blast were screened out of 52 parent materials. The conventional cultivars showed better resistance than that of maintainer and restorer lines. In comparison with ZB1 and ZB5， the races of ZA1， ZA9 and ZB9 showed stronger pathogenicity， with lower resistance frequency. The occurrence rates of Pi-ta gene and Pi54 gene（both were 0.42） were the highest， that of Pib（0.37） ranked the second. Pi-km gene had the lowest rate（0.06）. Pi9 gene was not found in all parent lines. The materials containing Pib+Pi54+Pi-km or Pi-ta+Pib+Pi54 showed higher resistance level than the plants with single or double resistance genes. 【Conclusion】Main indica rice patent materials in South China contain broad-spectrum resistance resources， which can broaden genetic background and breed resistant rice varieties. Multiple resistance genes pyramiding can strengthen the resistance of rice plant to different races of blast. More attention should be paid to the research and application of plants with multiple resistance genes.

Key words： indica rice； blast； resistance gene； broad-spectrum resistance resource； South China

0 引言

【研究意義】稻瘟病是由真菌[Mangnaporthe grisea （Hebert） barr]引起的一种世界性水稻病害，对水稻生产造成极其严重的危害（Zeigler et al.，1994；彭昌家等，2015）。近年来，稻瘟病对我国水稻造成的减产平均每年约44.6万t（刘万才等，2016），尤其华南地区高温高湿气候非常有利于水稻稻瘟病的流行，多次出现稻瘟病大面积暴发事件，严重危害我国粮食生产安全（朱小源等，2008，2010；何秀英等，2012）。培育抗病品种是目前防治稻瘟病最经济有效的措施，而鉴定发掘广谱高抗优异抗性资源是培育优良抗稻瘟病水稻品种的关键。【前人研究进展】已有研究表明，我国稻种资源中存在丰富的优良稻瘟抗源。韦燕萍等（2009）从1500份普通野生稻中鉴定出38份抗稻瘟病普通野生稻和18份抗瘟药用野生稻；张月雄等（2011）对抗瘟丝苗、新银占和BE621等3个抗稻瘟病品种的225份后代材料进行田间自然诱发鉴定，结果发现13份为1级抗性材料，118份表现中抗；谢倩凤等（2015）从82份水稻地方种质材料中分析获得宽抗谱材料11份、中等抗谱材料55份。除筛选优良抗源外，有关学者还对抗稻瘟病基因进行鉴定与评价。杨健源等（2008）研究表明，抗稻瘟病基因Pikh、Pi9和Pish对广东稻瘟病菌表现广谱抗性，且这些基因的聚合能提高水稻对稻瘟病的抗谱；欧阳冬梅等（2009）研究发现，携带抗稻瘟病基因Pibt（t）的Basmatic370突变体BTX对稻瘟病具有广谱抗性；何秀英等（2012）研究发现，粤晶丝苗2号携带有隐性抗稻瘟病基因pi55（t），广谱高抗七大类中国稻瘟病菌生理小种；颜群等（2012）从广西普通野生稻中鉴定出稻瘟病广谱抗性基因Pi-gx（t）；汪文娟等（2016）研究证实，华南地方稻种暹罗占含有广谱抗瘟基因Pi50。【本研究切入点】由于稻瘟病病原菌丰富多样的生理小种极易发生变异而导致抗性基因丧失抗性，因此在育种实践中需要不断发掘新的抗源，并对抗源所携带的抗病基因进行鉴定评价。【拟解决的关键问题】对52份华南地区常用籼稻亲本进行稻瘟病人工接种抗性鉴定和抗稻瘟病基因分子标记检测，筛选出适应华南生态条件的广谱高抗种质资源，分析亲本材料稻瘟病抗性与其所携带稻瘟病抗性基因间的关系，并对稻瘟病抗性基因的育种利用价值进行评价，为水稻稻瘟病抗性育种提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的52份籼稻亲本材料均由国家水稻改良中心南宁分中心收集提供。

1. 2 稻瘟病抗性鉴定

参照颜群等（2012）的方法进行稻瘟病人工接种鉴定。接种所用的14株菌株来自5个生理小种：ZA1（1、3和5号），ZA9（4、8、14和15号），ZB1（11、13、17、18和19号），ZB5（12号），ZB9（16号）。亲本材料种子经浸泡催芽后，点播于50 cm×35 cm×8 cm的育秧盘中，每盘18行，每行17粒发芽种子。幼苗2～3叶龄时移至接种箱进行喷雾接种，每盘接种40 mL含稻瘟病菌孢子3×105～4×105个/mL的悬浮液，然后置于黑暗条件下26 ℃保湿（相对湿度≥95%）培养24 h，再移至温室，定期喷雾保湿。接种7～10 d后待感病亲本出现典型病斑时，按Bonman等（1986）的标准调查病情，1～3级植株为抗病表型（R），4～5级植株为感病表型（S）。

1. 3 DNA提取及PCR扩增

采用CTAB法提取水稻叶片基因组DNA（Murray and Thompson，1980）。PCR反应体系20.0 μL：30 ng/μL基因组DNA 1.0 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 13.9 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，退火（退火温度见表1）45 s，72 ℃ 1 min，共进行35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经4.5%非变性聚丙烯酰胺胶电泳银染检测。所有扩增引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1. 4 抗稻瘟病基因检测

利用表1所列引物对52份籼稻亲本材料进行分析，根据检测结果判断稻株是否含有相关的稻瘟病抗性基因。YL155/YL87和YL183/YL87分别是抗病基因Pi-ta和感病基因pi-ta的特异检测引物组合，YL155/ YL87能扩增出1024 bp产物说明含有抗病基因Pi-ta，YL183/YL87能扩增出1024 bp产物说明携带感病基因pi-ta（Jia et al.，2002，2004）。PibdomF/PibdomR是抗病基因Pib的特异引物，能扩增出365 bp的目的片段（Fjellstrom et al.，2004）。Lys145F/Lys145R是抗病基因pib的特异引物，能扩增出803 bp的目的片段（刘洋等，2008）。pB8-F/pB8-R是抗病基因Pi9的特异引物，能扩增出700 bp的目的片段（Liu et al.，2002）。通过检验特异引物能否扩增出预期DNA片段，即可判断水稻植株中是否携带相对应的基因。Pi-km介导的稻瘟病抗性需要Pi-km1和Pi-km2两个基因同时存在才能完成。Ckm1F/Ckm1R和Ckm2F/Ckm2R分别是Pi-km1和Pi-km2共显性标记，预期产物分别是174 bp（R）/213 bp（S）和290 bp（R）/332 bp（S），两者均能扩增出目的片段，表明存在抗病基因Pikm（Costanzo and Jia，2010）。Pi54 MASF/Pi54 MASR是Pi54共显性标记，预期产物分别是216 bp（R）/359 bp（S）（Ramkumar et al.，2011）。

2 结果与分析

2. 1 广谱抗性材料筛选结果

经人工接种鉴定，发现亲本材料对稻瘟病病原菌5个生理小种14株菌株的平均抗性指数介于1.1～7.8（表2）。对14个菌株均表现为抗（R）的广谱抗性材料有2份，分别是五山丝苗和黄软占，抗谱达100.0%。另外，有2份宽抗谱材料（YR48和粤综占），其抗谱均为92.9%。其他材料的抗谱介于0～42.9%。

2. 2 材料抗性比较结果

在52份亲本材料中，恢复系材料22份，对14株菌株的平均抗性指数5.3；保持系材料16份，其平均抗性指数5.1；常规稻材料12份，其平均抗性指数4.2。经方差分析发现，恢复系与常规稻间的平均抗性指数存在显著差异（P<0.05，下同），其他类型材料间的平均抗性指数无显著差异（P>0.05）。

2. 3 生理小种的致病力

由表3可看出，ZA1生理小种包含3株菌株，在156个抗性鉴定反应中有23个表现为抗，抗性频率为0.15。ZB1生理小种包含5株菌株，在260个抗性鉴定反应中有84个表现为抗，抗性频率为0.32。ZB5生理小种只含有1株菌株，在52个抗性鉴定反应中有16个表现为抗，抗性频率为0.31。ZA9生理小种包含4株菌株，在208个抗性鉴定反应中有32个表现为抗，抗性頻率为0.15。ZB9生理小种也只有1株菌株，在52个抗性鉴定反应中有6个表现为抗，抗性频率为0.13。可见，ZA1、ZA9和ZB9生理小种较ZB1和ZB5生理小种表现出更强的致病力，具有较低的抗性频率。

2. 4 抗性基因的频率

利用设计的特异引物对52份籼稻亲本材料的Pi54基因进行检测（图1），同时检测Pi-ta、Pib、Pi-km和Pi9等4个稻瘟病抗性基因，结果表明，亲本材料所携带的基因数介于0～3（表2）。在52份籼稻亲本材料中，有22份携带Pi-ta基因，19份携带Pib基因，22份携带Pi54基因，3份携带Pi-km基因。Pi-ta和Pi54基因的出现频率最高，均为0.42；其次是Pib基因，出现频率为0.37；Pi-km基因的出现频率较低，仅0.06。所有籼稻亲本材料中均未检测出Pi9基因。

2. 5 基因组合的分布与抗性

由表4可知，仅含Pi-ta基因的籼稻亲本材料6份（11.5%），在84个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为5.1；仅含Pib基因的籼稻亲本材料8份（15.4%），在112个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为5.5；仅含Pi54基因的籼稻亲本材料4份（7.7%），在56个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为4.4；含双基因Pi-ta+Pib的籼稻亲本材料1份（1.9%），在14个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为4.9；含双基因Pi-ta+Pi54的籼稻亲本材料7份（13.5%），在98个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为5.3；含双基因Pib+Pi54的籼稻亲本材料2份（3.8%），在28个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为6.9；含双基因Pi-ta+Pi-km的籼稻亲本材料1份（1.9%），在14个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为3.9；含双基因Pi54+ Pi-km的籼稻亲本材料1份（1.9%），在14个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为5.5；含三基因Pi-ta+Pib+Pi54的籼稻亲本材料7份（13.5%），在98个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为3.4；含三基因Pib+Pi54+Pi-km的籼稻亲本材料1份（1.9%），在14个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为3.6。另外，有14份（26.9%）籼稻亲本材料未能检测出抗性目的基因，在196个抗性鉴定反应中的平均抗性指数为5.6。携带单基因Pi54的稻株抗性高于携带基因Pi-ta或Pib的稻株；携带Pi-ta+Pib和Pi-ta+Pi-km双基因稻株较携带Pi-ta或Pib单基因稻株表现出更强的抗性，但携带Pi-ta+Pi54、Pib+Pi54和Pi54+Pi-km双基因稻株较携带Pi-ta、Pib或Pi54单基因稻株表现出更弱的抗性；携带Pib+Pi54+Pi-km和Pi-ta+Pib+Pi54三基因稻株的抗性高于所有单基因或双基因稻株。

3 讨论

培育抗性品种是防治稻瘟病最经济有效的途径之一，但由于其病原菌生理小种的多样性和易变性，极易导致抗性品种丧失抗性，因此，在稻瘟病抗性育种实践中需要不断鉴定发掘广谱抗源。本研究从52份华南常用籼稻亲本中筛选获得广谱抗性材料4份，其中2份抗谱为100.0%，另2份抗谱为92.9%，表明从适应华南生态条件的籼稻亲本中发掘稻瘟病优良广谱抗源具有可行性。本研究还发现，常规稻较恢复系和保持系表现出更高的稻瘟病抗性，常规稻与恢复系的平均抗性指数间差异达显著水平。自20世纪80年代中后期以来，针对广东常规籼稻稻瘟病抗性差的问题，育种和植保工作者协同攻关，利用国外稻瘟病优良抗源对品种进行改良，已培育出一批抗病优良品种（朱小源等，2003），这些抗病优良品种对于华南常规稻品种改良有重要意义。此外，目前我国南方部分省（区）水稻品种审定委员会对新育成品种的抗稻瘟病性实行一票否决（张月雄等，2011）。可见，新形势迫切要求育种工作者继续加强广谱优良抗源的发掘鉴定和创新利用研究。

Pi-ta、Pib、Pi54、Pi-km和Pi9等5个基因能介导水稻对稻瘟病的广谱抗性，而基因特异分子标记的开发极大提高了广谱抗性基因的育种利用效率（Jia et al.，2002，2004；Liu et al.，2002；Fjellstrom et al.，2004；刘洋等，2008；Costanzo and Jia，2010；Ramkumar et al.，2011）。其中，Pi-ta基因被认为是高频率基因，而Pib是低频率基因（杨杰等，2011；李进斌等，2012；谢倩凤等，2015）。本研究发现在52份亲本材料中Pi-ta基因出现的频率最高（0.42），与李进斌等（2012）的研究结果相似；Pib和Pi54基因也具有较高的出现频率，分别为0.33和0.39。Pi-km属于稀有基因，携带该基因的材料较少（谢倩凤等，2015）；Pi9基因来自小粒野生稻（Oryza minuta），对稻瘟病具有广谱抗性（Liu et al.，2002）。本研究利用Pi9基因的特异引物pB8对籼稻亲本材料进行扩增，但未检测到该广谱抗性基因。抗性比对分析结果表明，携带单基因Pi54的稻株抗性高于携带基因Pi-ta或Pib的稻株，因此应重视该基因的育种利用；携带Pi-ta+Pib和Pi-ta+Pi-km双基因稻株较携带Pi-ta或Pib单基因稻株表现出更强的抗性，但携带Pi-ta+Pi54、Pib+Pi54和Pi54+Pi-km双基因稻株较携带Pi-ta、Pib或Pi54单基因稻株表现出更弱的抗性，其原因可能是抗稻瘟病基因数量较多，本研究仅分析其中的5个抗性基因，稻株抗性是否还受到其他未检测抗稻瘟病基因的调控，尚有待进一步探究。范方军等（2014）研究发现，稻株同时存在Pib、Pi54和Pi-km基因时对稻瘟病抗性得到明显提高。本研究也发现，携带Pib+Pi54+Pi-km和Pi-ta+Pib+Pi54三基因稻株的抗性高于所有單基因或双基因稻株，进一步说明多个抗性基因聚合能有效提高稻株对稻瘟病不同生理小种的抗性。

4 结论

华南常用籼稻亲本材料中存在着优良的稻瘟病广谱抗源，可利用这些抗源拓宽育种材料的遗传背景，培育抗病优良品种。多个抗性基因聚合能有效提高稻株对稻瘟病不同生理小种的抗性，在育种实践中应加强多基因聚合材料的创制和利用研究。

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（責任编辑 兰宗宝）