甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析

曹辉庆　蒋胜理　黄诚梅　邓智年　吴凯朝　徐林　陆珍　陈丽君　李秋凤　魏源文

摘要：【目的】克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因（ScCDPK1），为其功能解析和育种利用打下基础。【方法】根据甘蔗cDNA文库中的CDPK基因序列信息设计引物，利用RT-PCR克隆ScCDPK1基因，并采用在線生物信息学分析软件对其推导蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析。【结果】克隆获得的ScCDPK1基因完整编码区大小1650 bp，编码549个氨基酸，相对分子量61.971 kD，等电点（pI）6.78，不稳定指数35.63。同源性和遗传进化树分析结果显示，ScCDPK1基因与小麦TaCPK7基因亲缘关系最近，同源性达88%；ScCDPK1蛋白与其他已知CDPK蛋白一致，具有CDPKs家族特有的4个保守区域（可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区），其二级结构主要由α螺旋（42.80%）和无规则卷曲（32.97%）构成；蛋白功能分类预测结果显示，ScCDPK1蛋白是一种阳离子通道蛋白，可能参与植物胁迫应答、信号转导和翻译调控等生物反应。【结论】ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致，具有CDPKs家族特有的4个保守区域，是一种阳离子通道蛋白。

关键词： 甘蔗；钙依赖蛋白激酶基因（CDPK）；克隆；序列分析；生物信息学预测

中图分类号： S566.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0574-07

Abstract：【Objective】The calcium-dependent protein kinase gene in sugarcane（ScCDPK1） was cloned to provide re-

ferences for revealing its biological functions and further utilization in breeding. 【Method】The specific primers were designed according to known CDPK gene sequence from sugarcane cDNA library. ScCDPK1 gene was cloned using RT-PCR. The physical and chemical properties， transmembrane domain， signal peptide， and conserved domains were analyzed using online bioinformatics algorithms. 【Result】The full coding sequence of ScCDPK1 gene was cloned， which included 1650 bp in length and encoded 549 amino acid residues. Its relative molecular weight was 61.971 kD， isoelectric point（pI） 6.78 and instability index 35.63. Homology and phylogenetic tree analysis showed that ScCDPK1 of sugarcane shared the closest genetic relationship with TaCPK7 of wheat and had 88% similarity. Like other known CDPK proteins， ScCDPK1 protein contained four conserved domains（variable domain， protein kinase domain， self-inhibition domain and calcium binding domain）. Its protein secondary structure mainly consisted of alpha helix（42.80%） and random coil（32.97%）. Protein functional analysis showed that ScCDPK1 protein was a kind of cation channel protein which play important roles in many biology processes such as plant stress response， signal transduction and translation. 【Conclusion】Like other known CDPK proteins， the protein encoded by ScCDPK1 gene contains four conserved domains which is peculiar to CDPKs family. And it is a cation channel protein.

Key words： sugarcane； calcium-dependent protein kinase（CDPK）； cloning； sequence analysis； bioinformatic prediction

0 引言

【研究意义】甘蔗（Saccharum spp. hybrids）是重要的糖料和能源作物，主要栽培于热带及亚热带地区。广西是我国甘蔗主产区，但蔗区主要分布在缺乏灌溉条件的旱坡地上，干旱是影响广西甘蔗生产的主要因素之一，严重制约了蔗糖产业的可持续发展（李杨瑞等，2011；刘鹏飞等，2015；谭芳等，2016）。钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPK）是一类广泛存在于植物细胞中的钙传感蛋白，具有Ca2+结合功能和丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶活性，通过参与细胞Ca2+信号传导调控下游基因表达，在植物应答胁迫反应中发挥重要作用（Harmon et al.，2001）。因此，克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因（ScCDPK1）并进行生物学功能分析，有助于探明甘蔗应答干旱胁迫的分子机制，为甘蔗抗旱育种提供参考依据。【前人研究进展】CDPK为分子量40～90 kD的单肽链蛋白，主要包含4个保守结构域，即可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区（Cheng et al.，2002）。CDPK在植物中为多基因家族，目前已鉴定拟南芥中存在34个成员（Cheng et al.，2002；Harper et al.，2004；Harper and Harmon，2005）、水稻中存在31个成员（Asano et al.，2005；Ray et al.，2007）、小麦中存在20个成员（Li et al.，2008）、玉米中存在40个成员（Kong et al.，2013）、棉花中存在41个成员（Liu et al.，2014）。此外，在苹果（Battey and Venis，1988）、芒果（Frylinck and Dubery，1998）、烟草（Yoon et al.，1999）和马铃薯（Kobayashi et al.，2007）等植物中也陆续克隆鉴定出CDPK基因。CDPK基因受赤霉素、生长素、干旱、高盐、低温、病原菌入侵和机械损伤等外界刺激诱导表达（Romeis et al.，2001；Wan et al.，2007；Boudsocq and Sheen，2013；Schulz et al.，2013）。Saijo等（2000）研究表明，超表达OsCDPK7和OsCPK13基因可增强转基因水稻植株抵御低温干旱和盐分胁迫的能力；Wan等（2007）研究发现，稻瘟病菌可诱导水稻OsCPK2、OsCPK9、OsCPK15和OsCPK17基因上调表达；Coca和San Segundo（2010）发现AtCDPK1通过正调控水杨酸（SA）信号传导途径而提高拟南芥的抗病性。【本研究切入点】至今，有关ScCDPK1基因的序列及结构等分子生物学特性尚未明确，且这方面的研究报道甚少。【拟解决的关键问题】从水分胁迫处理的甘蔗cDNA文库（罗海斌等，2012）中克隆获得ScCDPK1基因，对其序列同源性、遗传进化、推导蛋白理化性质、结构与功能进行预测分析，旨在为ScCDPK1基因的功能解析和育种利用打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试甘蔗品种为新台糖22号（ROC22），由广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室提供。苗期取+1叶叶片迅速进行液氮固定，-80 ℃保存备用。pMD18-T载体、Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司，RNA提取试剂盒（RNAprep Pure Plant Kit）购自天根生化科技（北京）有限公司，cDNA合成试剂盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）购自北京全式金生物技术有限公司。

1. 2 甘蔗总RNA提取及cDNA合成

参照RNAprep Pure Plant Kit试剂盒说明提取甘蔗叶片总RNA，用紫外分光光度计和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度及完整性。参照Trans-

Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明合成cDNA第一链。

1. 3 引物设计及目的基因克隆

根据从甘蔗cDNA文库中获得的ScCDPK1基因序列，设计1对特异性引物（CDPK-F：5'-ATGGGCAACT

GCTGCGTGA-3'，CDPK-R：5'-CTACCGTGTACTCGT

CATCTGC-3'）。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

PCR反应体系25.0 μL：10×Buffer（Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 2.0 μL，CDPK-F （10 μmol/L） 0.5 μL，CDPK-R（10 μmol/L） 0.5 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 17.3 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。回收产物连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜，筛选阳性克隆送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

1. 4 目的基因序列分析

运用NCBI在线程序BLAST对目的基因进行同源比对分析；以MEGA 6.06中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建目的基因的系统发育进化树；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）预测推导蛋白的理化性质；利用ProtScale（http：//web.expasy.org/

cgi-bin/protscale/protscale.pl）计算推导蛋白的疏水性图谱；利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/

services/TMHMM/）预测推导蛋白的跨膜结构；利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/

SignalP/）预测推导蛋白是否含有信号肽；采用Clustal X对目的基因与同源基因推导的氨基酸序列进行多序列比对；使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）预测目的基因推导蛋白的功能域；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl）预测推导蛋白的二级结构；利用SWISS-MODEL（https：//

swissmodel.expasy.org/）预测推导蛋白的三级结构；利用Softberry（http：//www.softberry.com/berry.phtml？topic=protcom-ppl&group=programs&subgroup=proloc）网站完成亚细胞定位预测；利用ProtFun 2.2 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）对目的基因推导蛋白进行功能分类。

2 结果与分析

2. 1 ScCDPK1基因的克隆

以甘蔗新台糖22号的叶片总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得约1700 bp的单一条带（图1），其序列分析结果显示，该片段大小1650 bp，包含一个基因的完整编码区（图2）。将克隆获得的基因序列提交至GenBank进行BLAST比对分析，结果显示，该序列与小麦的TaCPK7基因同源性最高，达88%，与水稻、玉米、香蕉、烟草和拟南芥等植物CDPK基因的同源性在66%～76%（表1）。因此，确定克隆获得的基因序列为甘蔗CDPK基因，命名为ScCDPK1（登录号KX908136）。

2. 2 ScCDPK1基因遗传进化树分析结果

采用MEGA 6.06中的邻接法（NJ）构建基于CDPK基因的系统发育进化树（图3），结果显示，ScCDPK1基因與小麦的TaCPK7基因亲缘关系最近，与同源性比对分析结果一致。

2. 3 ScCDPK1蛋白的理化性质及亲/疏水性预测结果

由ProtParam在线分析结果可知，ScCDPK1基因编码549个氨基酸，分子式为C2736H4343N781O816S23，相对分子量61.971 kD，等电点（pI）6.78，不稳定指数35.63，推定该蛋白属于稳定蛋白，平均亲水系数（GRAVY）-0.519，预测该蛋白为亲水性蛋白。ScCDPK1蛋白含丙氨酸（Ala，8.7%）、亮氨酸（Leu，8.6%）、赖氨酸（Lys，7.8%）、谷氨酸（Glu，7.7%）和天冬氨酸（Asp，7.5%）。这5种氨基酸所占比例达40.3%，而色氨酸（Trp）所占比例最低，仅0.9%。

利用ProtScale计算ScCDPK1蛋白的疏水性图谱，结果（图4）显示，ScCDPK1蛋白中亲水性氨基酸占71.04%，疏水性氨基酸占27.50%，亲水区域均匀地分布在整个肽链中，分值较高；疏水区域较少，分值较低。因此推测ScCDPK1蛋白为亲水性蛋白。

2. 4 ScCDPK1蛋白的跨膜区域与信号肽预测分析结果

利用TMHMM Server v.2.0和SignalP 4.1 Server分析发现，ScCDPK1蛋白不具备跨膜结构和信号肽，是一种在细胞内发挥生理作用的非分泌蛋白。

2. 5 ScCDPK1同源蛋白的多序列比对分析结果

采用Clustal X对ScCDPK1同源蛋白进行多序列比对分析，结果（图5）表明，ScCDPK1蛋白与其他已知的CDPK蛋白一样，具有CDPKs家族所特有的4个保守区域（可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区）。其中，N端可变区起始序列为MGNCCVT，是豆蔻酰化、棕榈酰化作用所需的保守序列MGxxCxT（Stael et al.，2011）；激酶区含有11个高度保守的催化结构域；钙离子结合区含有4个EF手型结构域。

2. 6 ScCDPK1蛋白功能域的预测结果

利用SMART预测ScCDPK1蛋白的功能域，结果表明，該蛋白位于10～36 aa的区域为1个低复杂度区域（Low complexity region），位于67～332 aa的区域为Ser/Thr蛋白激酶催化区，在位于379～407、415～443、451～479和487～515 aa的区域分别存在4个EF手型基序，每个基序由30个左右的氨基酸残基组成（图6 ）。

2. 7 ScCDPK1蛋白的二级结构及三级结构预测结果

采用SOPMA预测ScCDPK1蛋白二级结构，结果（图7）表明，ScCDPK1蛋白由42.80%的α螺旋（235个氨基酸残基）、32.97%的无规则卷曲（181个氨基酸残基）、14.21%的延伸链（78个氨基酸残基）和10.02%的β转角（55个氨基酸残基）构成，即α螺旋和无规则卷曲是ScCDPK1蛋白二级结构的主要构成元件。采用SWISS-MODEL同源建模方式得到ScCDPK1蛋白的三维预测模型（图8），发现该蛋白质主要由α螺旋和无规则卷曲构成，与二级结构预测结果基本一致。

2. 8 ScCDPK1蛋白的亚细胞定位和功能分类

采用ProtComp 9.0对ScCDPK1蛋白进行亚细胞定位预测，结果表明ScCDPK1蛋白定位在细胞质膜上。利用ProtFun 2.2 Server对ScCDPK1蛋白进行功能分类（表2），其基因功能分类结果显示该蛋白可能是翻译调控蛋白，而基因本体分类进一步预测该蛋白是一种阳离子通道蛋白，可能参与胁迫应答、信号转导、免疫应答等生物反应。

3 讨论

CDPK通过磷酸化作用将逆境胁迫引发的Ca2+信号向下游级联传递，进而引起相关基因表达量的变化，提高植物对不良环境胁迫的耐受性（Ludwig et al.，2005；Xie et al.，2014）。CDPK在拟南芥、水稻和玉米等作物中已得到系统研究，但有关甘蔗CDPK基因序列及其功能结构等分子生物学特性尚未明确。本研究根据甘蔗cDNA文库中CDPK基因序列设计引物进行ScCDPK1基因克隆，并将克隆获得的目的基因进行同源性比对和遗传进化树分析，结果表明，ScCDPK1基因与其他植物CDPK基因的同源性在66%以上。同时，采用在线生物信息学分析软件对ScCDPK1基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析，结果发现ScCDPK1蛋白存在1个Ser/Thr蛋白激酶亚结构域和4个促进Ca2+结合的EF手型结构，符合CDPK的典型特征（Stone and Walker，1995），说明已成功克隆获得甘蔗CDPK基因。多数CDPK在N端含有与膜定位相关的豆蔻酰化、棕榈酰化位点MGxxCxT（Stael et al.，2011），ScCDPK1蛋白N端可变区起始序列为MGNCCVT，具有定位于细胞膜上的特征。

植物中CDPK以多基因家族形式存在，广泛参与植物逆境胁迫的分子响应。如Urao等（1994）研究发现，拟南芥在受到干旱和盐分胁迫后，植株中CDPK基因的表达量急剧增加。CDPK基因的表达还与植物应答病原微生物入侵相关，如稻瘟病菌可诱导水稻OsCPK2、OsCPK9、OsCPK15和OsCPK17基因上调表达（Wan et al.，2007）。此外，有研究发现CDPK与植物体内蔗糖积累存在负相关，通过磷酸化作用调节蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性，进而调控植物体内蔗糖代谢（Hardin et al.，2004；Papini-Terzi et al.，2009），但有关ScCDPK1蛋白在甘蔗中的确切功能有待进一步研究验证。

4 结论

ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致，具有CDPKs家族特有的4个保守区域，是一种阳离子通道蛋白。

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（責任编辑 兰宗宝）