低温胁迫下苦瓜幼苗差异蛋白的表达与分析

黄玉辉　梁家作　黄熊娟　冯诚诚　黄如葵　陈小凤　刘杏连　陈振东　秦健

摘要：【目的】寻找与苦瓜苗期耐低温表达调控相关的蛋白，深入了解苦瓜抗低温机理，为下一步开展苦瓜耐低温分子基础研究及苦瓜耐低温育种打下基礎。【方法】以耐冷型MC108和冷敏型MC6苦瓜品种为材料，运用双向电泳技术分析低温胁迫（8 ℃低温胁迫72 h）下苦瓜苗期叶片蛋白质差异变化。【结果】对2-DE图谱分析发现，冷敏型MC6和耐冷型MC108苦瓜品种间共存在82个差异蛋白点，其中，39个蛋白点上调，36个蛋白点下调，2个新增蛋白点，5个消失蛋白点；对其中24个表达量变化明显的蛋白质点进行MALDI-TOF-TOF/MS 分析，经数据库搜索匹配，鉴定出5个未知蛋白和14个功能蛋白，这些蛋白涉及细胞防御、自由基清除、光合作用、基础代谢、蛋白降解等多个功能类别。【结论】在逆境胁迫下苦瓜可通过调节多种蛋白表达来适应外界温度的变化。

关键词： 苦瓜；低温胁迫；差异蛋白；表达

中图分类号： S642.5 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0594-07

Abstract：【Objective】In the present study， the proteins related to cold resistance regulation of Momordica charantia L. at seedling stage were searched for so as to explore mechanism of resistance to low temperature and laid foundation for M. charantia L. cold resistance molecule research and cold resistance variety breeding. 【Method】Cold-susceptible M. charantia L. MC6 and cold-resistant M. charantia L. MC108 were taken as materials. Difference of proteins in M. charantia L. leaves at seedling stage under low temperature stress（8 ℃ for 72 h） was analyzed by two dimensional electrophoresis. 【Result】2-DE map indicated that there were 82 differential protein spots between cold-susceptible M. charantia L. MC6 and cold-resistant M. charantia L. MC108. Among these protein spots， thirty-nine up-regulated， thirty-six down-regulated， two were newly added and five disappeared. MALDI-TOF-TOF/MS analysis was conducted on 24 proteins spots with obvious expre-

ssion difference. Through searching and matching in database， five unknown proteins and fourteen functional proteins were detected. These proteins were involved in cytophylaxis， radicals scavenging， photosynthesis， basic metabolism and protein degradation. 【Conclusion】Under stress， M. charantia L. can adapt to the temperature variation through regulating multiple proteins.

Key words： Momordica charantia L.； low temperature stress； differential protein； expression

0 引言

【研究意义】苦瓜（Momordica charantia L.）起源于东南亚的热带地区，为葫芦科苦瓜属，短日照、冷敏性蔬菜，营养丰富，尤其维生素C含量位列瓜果类蔬菜之首，具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗菌及提高人体免疫力等功效，为我国城乡居民菜、药兼用。为了实现苦瓜周年供应和全面提高苦瓜生产的经济效益，近年来各地大力发展苦瓜四季栽培技术，但由于我国大部分地区冬春季节气温低，严重制约了苦瓜的全年生产，其中广西大多数地方常出现冬季寒露风和春季低温天气，尤其2～4月冷空气南下频繁，与南方暖湿气流交汇，形成连续或断续的低温阴雨天气，导致苦瓜等喜温性蔬菜落花落果而减产或绝收，严重阻碍了广西苦瓜产业的可持续发展。因此，突破低温对苦瓜正常生长的危害是实现苦瓜全年生产，尤其是反季节生产的关键所在。【前人研究进展】双向电泳作为一种快速、简单、高效分离蛋白点的方法近年来已成为研究植物对逆境胁迫应答的重要手段。目前，已研究发现逆境胁迫下诱导的胁迫蛋白、热激蛋白和抗病蛋白等在抗胁迫中发挥着重要作用。在低温胁迫应答方面，Griffith等（1992）从冷适应冬麦质体中分离到具有较高抗冻活性的抗冻蛋白（AFS），这种蛋白与病原相关蛋白相似，靠积累突变进化形成结合冰的能力。Hincha等（1997）从甘蓝叶片中纯化出一种具有冷保护活性的28.5 kD的“沸腾—稳定”蛋白（低温保护素），其冷保护活性与一个冷诱导的7 kD糖蛋白（热激蛋白）有关。李锐等（2010）通过蛋白双向电泳和质谱分析，研究了低温胁迫下棉花幼苗蛋白质的含量变化，结果表明，不同品种棉苗在低温胁迫前后表达量存在明显差异，得到了30个蛋白指纹图谱，其中逆境蛋白占20%。随着蛋白质组学技术的广泛应用，更多与低温胁迫响应相关的蛋白在水稻、大豆、豌豆、油菜、玉米、小麦、香蕉和茭白等植物中被发现（阮松林等，2006；王巍等，2011；杨猛等，2013；苍晶等，2014；金晔等，2015；张春等，2015；周国华等，2016），这些逆境蛋白可增强细胞对各种逆境的抵抗能力，进而提高植物的生存能力。【本研究切入点】目前，有关低温胁迫下苦瓜差异蛋白的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】以耐冷型MC108和冷敏型MC6苦瓜品种为材料，利用蛋白质组学技术，比较不同耐冷苦瓜材料在低温胁迫下叶片蛋白质组的变化，以深入了解苦瓜抗低温机理，为今后开展苦瓜耐低温分子基础研究及苦瓜耐低温育种打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试耐冷型MC108和冷敏型MC6苦瓜品种分别来自山东和广西。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 供试苦瓜种植 采用室外盆栽播种，正常水肥管理，待苦瓜幼苗长至4叶1心时，处理在光照培养箱中8 ℃低温胁迫72 h，空白对照在常温继续培养。每处理植株15株，3次重复。

1. 2. 2 苦瓜叶片全蛋白提取 苦瓜叶片蛋白提取参考Saravanan和Rose（2004）的方法并稍加改进：将1 g苦瓜叶片（加20% PVPP）液氮研磨成粉，加入10 mL提取液[含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），50 mmol/L EDTA（pH 8.0）， 0.7 mol/L蔗糖，0.1 mol/L KCl]和10 mL Tris饱和酚，充分混匀后低温放置30 min；4 ℃下10000 r/min离心15 min，弃上清液，加入等体积的提取液，充分混匀后于低温放置30 min；4 ℃下10000 r/min离心15 min，弃上清液，加入5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分混匀后-20 ℃沉淀过夜；加入5 mL丙酮对蛋白进行洗涤，用移液器（1 mL）反复吹打均匀后，4 ℃下10000 r/min离心15 min；重复操作1次；弃上清液后，室温干燥，-80 ℃保存备用。

1. 2. 3 双向电泳（2D-PAGE） 第一相等电聚焦电泳（IEF）：计算蛋白上样量，银染用120 μg，考染用800 μg；按浓度取蛋白上清液，加入水化液（含8 mol/L Urea，2% CHAPS，18 mmol/L DTT，0.5% IPG Buffer pH 3～10，0.002%溴酚蓝），选用24 cm pH 4～7胶条进行水化；采用GE ETTAN IPGPHOR 3等电聚焦系统进行等电聚焦，电泳参数为300 V 30 min、700 V 30 min、1500 V 1.5 h、9000 V 3.0 h、9000 V 4.0 h。第二相聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：用垂直电泳系统制备聚丙烯酰胺凝胶，分离胶浓度为12%，电泳参数为80 V 30 min左右，之后为200 V 5 h，直至溴酚蓝前沿离胶下沿0.5 cm处停止电泳。电泳结束后取出凝胶切角标记并进行银染显色。

1. 2. 4 凝胶扫描、图谱分析和质谱鉴定 凝胶银染后用扫描仪（Image scanner）扫描，分辨率为300 dpi，获取凝胶图像。用ImageMaster 2D Platinum 5.0（GE）对凝胶图谱进行分析。建立4组凝胶图像分析组，组1为MC6空白对照（MC6-CK），组2为经低温处理的冷敏型苦瓜种质材料MC6（MC6-CL），组3为MC108空白对照（MC108-CK），组4为经过低温处理的耐冷型苦瓜种质材料MC108（MC108-CL），每处理3张重复双向图谱，分别进行组内和组间蛋白质点表达丰度比较，获得蛋白质点差异表达变化信息。差异蛋白点的筛选标准为丰度变化差异量为150%的点。

选取本研究中高清晰度、重复性好、丰度变化在150%以上的24个蛋白差异点进行MALDI-TOF-TOF串联质谱分析。将获得完整的肽指纹图谱测定结果通过NCBInr和SWISSPROT数据库搜索比对；物种检索选择All，数据检索方式选择Combined；不完全裂解位点的最大允许值为1个；质量误差范围为50 mg/L。

2 结果与分析

2. 1 供试材料苗期耐冷性表现

经低温处理后冷敏型苦瓜MC6幼苗功能叶片出现水渍斑并连成大片，部分功能叶片失水萎蔫，新生叶片皱缩；耐冷型苦瓜MC108新生叶片稍微卷曲、叶色正常，表明MC108具有良好的低温耐受能力（图1）。

2. 2 苦瓜叶片蛋白2-DE图谱分析

利用ImageMaster 2D Platinum 5.0（GE）分析在低温胁迫下冷敏型和耐冷型苦瓜材料幼苗叶片的双向电泳图谱，结果（图2）表明，银染后图谱上差异蛋白点具有良好的重复性和匹配率，可用于后续分析。每个蛋白双向电泳凝胶图谱上均检测到2100个左右的有效蛋白点。经软件统计分析表明，与对照组比较，冷敏型MC6品种图谱存在43个显著差异的蛋白点，其中12个蛋白点上调，30个蛋白点下调，1个消失蛋白点；耐冷型MC108苦瓜品种图谱存在39个显著差异的蛋白点，其中27个蛋白点上调，6个蛋白点下调，2个新增蛋白点，4个消失蛋白点。

2. 3 差异蛋白点质谱分析和数据库鉴定结果

对选出的MC6-CK～MC6-CL组及MC108-CK～

MC108-CL组中高清晰度、重復性好、丰度变化在150%以上的24个蛋白差异点（表1）进行质谱分析，并将获得完整的肽指纹图谱测定结果通过数据库搜索比对，成功鉴定出19个蛋白质（表2），包括5个未知蛋白和14个功能蛋白，结合数据库检索和相关文献报道，对成功鉴定的19个蛋白质进行功能分析，结果显示，这些相关蛋白参与细胞防御、自由基清除、光合作用、基础代谢、蛋白降解等多个生理过程。

3 讨论

3. 1 关于低温胁迫苦瓜S-腺苷甲硫氨酸合成酶上调的应激功能

S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）是催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成的主要酶类，而SAM是多胺、乙烯和谷胱甘肽等生物合成的前体。近年来的研究表明，多胺（陈坤明和张承烈，2000；关军锋等，2003；杨建昌等，2004）、乙烯（Yang and Hoffman， 1984）和谷胱甘肽（Estcrbhauer and Grill，1978；Sehupp and Rennenbrry，1988；Salt and Rauser，1995）在植物受到干旱、化学、病虫害等逆境胁迫下可提高植物抗逆性，推测SAMS在植物抗逆中发挥重要作用。Mathur等（1992）研究发现拟南芥、水稻中SAMS基因的表达在水分胁迫时表达量增加。余涛等（2004）发现SAMS基因的表达受氧化胁迫及高温胁迫的诱导，并从烟草中克隆获得SAMS基因。本研究结果显示，冷敏型MC6苦瓜幼苗在低温胁迫下SAMS基因无明显变化，而耐冷型MC108苦瓜幼苗的SAMS基因受低温胁迫诱导呈上调表达，有利于促进大量合成多胺和谷胱甘肽以抵御低温胁迫，从而减少外界逆境胁迫的伤害。

3. 2 关于低温胁迫苦瓜GDP-甘露糖-3，5-表异构酶上调的应激功能

植物中外界环境胁迫会引起氧化猝发，造成活性氧过度积累，从而对植物造成一定伤害。活性氧对植物的细胞毒性很强，如果没有足够的保护机制，它们可以与蛋白质、脂质和核酸反应而灭活重要的防御系统，从而导致植物不可挽回的代谢功能障碍甚至死亡（Hossain et al.，2011）。L-抗坏血酸（L-ascorbic acid，AA）作为细胞内的一种还原物质，可通过逐级供给电子而转变为半脱氧抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的过程清除体内超负氧离子、有机自由基和有机过氧基等，保护植物体免受活性氧的危害。而GDP-甘露糖-3，5-表异构酶（GDP-mannose-3'，5'-epimerase，GME）是催化GDP-D-甘露糖合成AA的主要酶类。本研究以8 ℃处理苦瓜幼苗72 h，冷敏型MC6苦瓜幼苗的GME表达量变化不明显，而耐冷型MC108苦瓜幼苗的GME表达量是对照的2.3倍，表达量明显上调。与此相似的研究也有一些报道，杜盈等（2005）分别在15、10和5 ℃不同低温条件对2个水稻的GME基因进行低温处理24 h，发现OsGME1基因表达量上升，而OsGME2基因没有明显变化；王江英等（2012）4 ℃处理棉花幼苗8 h后，发现GME表达量上调。

3. 3 关于低温胁迫苦瓜26S蛋白酶体调节亚基11上调的应激功能

26S蛋白酶体包括20S的核心结构和两端19S的调控结构，后者又分为ATP和非ATP依赖的多亚基构成。其依赖泛肽ATP降解目标蛋白，是真核细胞选择性降解蛋白质的一种途径，即泛肽途径（Fu et al.，1999）。泛肽途径对于清除异常蛋白质维护细胞的稳定性具有重要作用，成为植物应对非生物胁迫的一种重要调控途径（Lommel et al.，2000；Peng et al.，2001）。本研究发现，在低温胁迫下有一个蛋白点被鉴定为26S蛋白酶体调节亚基11，可能是26S蛋白酶体的组成部分，在耐冷型MC108苦瓜叶片中表达量上调，推测可能是耐冷型苦瓜MC108对低温胁迫的一种应激响应机制。

3. 4 关于低温胁迫苦瓜铁蛋白上调的应激功能

铁蛋白在低温、干旱、病虫害等胁迫条件下受环境信号的诱导而积累（Lobréaux and Briat，1991）。当植物处于逆境胁迫条件下时，氧化胁迫即占主要地位，抗氧化作用的防御能力减弱，由铁介导的自由基增强，导致代谢失调、脂肪过氧化、蛋白质分解和DNA损伤（习阳等，2003）。由于铁蛋白是一种以稳定的形式专门储存铁的蛋白质，因此其对植物抵抗逆境胁迫有重要作用。本研究发现，在低温胁迫下，冷敏型苦瓜MC6铁蛋白表达量下调，而耐冷型苦瓜MC108铁蛋白表达量上调，推测耐冷型苦瓜MC108铁蛋白表达量增加与苦瓜耐冷性增强对低温的适应性反应有关。

本研究初步在蛋白质水平上揭示了苦瓜幼苗在低温胁迫下的差异蛋白表达情况，所涉及的差异蛋白只是苦瓜蛋白质组中的一小部分，更多的低温胁迫响应蛋白和基因表达机制有待深入研究。对已获得的抗性相关蛋白，需要进一步应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆相关基因并进行Western blottling验证，以确定其功能。在获得的差异蛋白点中，并不是所有蛋白点都能成功检测，可能是由于差异蛋白为逆境过程的低丰度蛋白，且分离过程中可能會丢失蛋白；也有可能是受限于胶条pH范围、凝胶浓度和规格及蛋白提取纯度等原因。另外，在本研究中苦瓜叶片蛋白表达量因材料不同而发生了相应变化，其原因可能是不同苦瓜材料对应激响应的机制与应急应答能力不同。

4 结论

应用差异蛋白质组学方法分析耐冷型和冷敏型苦瓜材料叶片低温处理后的差异蛋白，从2-DE凝胶上均检测到清晰且重复性好的蛋白质点均超过2100个，共获得表达量差异在150%以上的差异蛋白75个。选取其中24个差异表达蛋白进行串联质谱鉴定，将差异蛋白点获得完整的肽指纹图谱测定结果通过MASCOT数据库搜索比对，共成功鉴定出19个蛋白点，这些功能蛋白参与细胞防御、自由基清除、光合作用、基础代谢、蛋白降解等多个生理过程。通过对低温胁迫下苦瓜差异蛋白的研究可知，苦瓜抗冷性能可通过相关蛋白表达量的调控来实现。

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（責任编辑 麻小燕）