金鱼草花青素糖基转移酶基因的克隆与表达特性分析

燕一波　郭玉双

摘 要 以白苏子（Perilla frutescens）花青素糖基转移酶基因为探针，通过电子克隆和RT-PCR的方法从金鱼草（Antirrhinum majus L.）叶片中克隆到花青素糖基转移酶基因（AmGT1）的全长cDNA，并对其表达特性进行分析。结果表明：AmGT1全长892 bp，编码277个氨基酸；进化分析表明AmGT1的氨基酸序列与白苏子的同源性最高为79%，与其他花青素糖基转移酶蛋白的同源性在42%～62%之间，表明AmGT1是从金鱼草中克隆的新的花青素糖基转移酶基因。实时定量RT-PCR分析表明：该基因在金鱼草叶片中的表达量最高，根中的表达量最低；该基因虽然在红色、粉色、黄色、白色花朵中均有表达，但在红色花朵中的表达量最高，且存在一个从紧蕾期到松蕾期的跃变。

关键词 金鱼草；花青素；糖基转移酶基因；表达分析

中图分类号 Q342.3 文献标识码 A

Abstract The full-length cDNA of the anthocyanin glycosyltransferase gene（AmGT1）in snapdragon（Antirrhinum majus L.）was isolated through in silico cloning and RT-PCR confirmation based the anthocyanin glycosyltransferase gene of the common perilla（Perilla frutescens）as the probe. The sequence and expression characteristics were further analysed. The full-length of AmGT1 was 892 bp， encoding 277 amino acids. Phylogenetic analysis showed that the sequence identity between AmGT1 and Perilla frutescens was 79%， displaying the highest consistency and sequence identity with other found GT proteins was between 42%-62%. These results indicated that AmGT1 was a new-found plant glycosyltransferase gene. Quantitative RT-PCR analysis revealed that the expression level of AmGT1 was the highest in the leaf and lowest in the root； AmGT1 was expressed in red， pink， yellow and white flowers； but the expression level of red flowers was the highest and there was a jump from tight bud stage to loose bud stage.

Key words Snapdragon； anthocyanin； glycosyltransferase gene； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.019

花青素是類黄酮代谢途径的分支产物，可以影响植物组织表面的温度、气味、颜色、湿度、质感、光学特性等一系列生物学特征，并具有保健价值。花青素产生的这种生物独特性是修饰基团、PH值、金属离子等多种因素共同决定的。糖基化、甲基化、酰基化修饰是花青素常见的修饰基团[1]。在花青素糖基化修饰研究中，类黄酮3-O-糖基转移酶（3GT）和类黄酮5-O-糖基转移酶（5GT）是被发现的2种常见糖基转移酶[2]。3GT和5GT均属于UDPGT型糖基转移酶超家族（GTs）的成员[3]，由MYB基因编码[4]，Bronze1（bz1）和Bronze2（bz2）基因调控[5]，是花青素合成过程中的最后一个关键酶[6]。糖基转移酶作用于花青素合成的后期，通过修饰基团的类别、稳定性和位置对花青素的呈色、稳定性产生影响。有研究报道，矮牵牛dusky基因编码的糖基转移酶插入突变引起花瓣颜色变化[7]，这说明糖基转移酶与花色基因工程、显色机理相关。因此，糖基转移酶可做为在花青素分子水平上的呈色机制、花色修改[8]研究和实现花色基因工程[9]的一个切入点。

金鱼草（Antirrhinum majus L.）因花型独特、花色艳丽丰富，用于切花、花槽、花坛、花池、花境等，是重要的观赏植物；也是分子生物学研究的模式植物之一，以金鱼草作为研究对象，研究花青素糖基转移酶基因的序列组成和表达特性，可了解花青素糖基转移酶体外酶促反应，有助于阐明金鱼草糖基转移酶的生物学功能，为研究花青素糖基转移酶基因工程提供理论依据。目前对金鱼草花青素生物合成方面的研究主要集中在相关基因（如delila、roseal）的分离克隆、蛋白质纯化、转座子标签等。本研究通过电子克隆和RT-PCR的方法从金鱼草（Antirrhinum majus L.）叶片中克隆到金鱼草花青素糖基转移酶基因（AmGT1）的全长cDNA，并对其表达特性进行了分析，为进一步基因功能研究奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试金鱼草塔希提（Antirrhinum ‘Tahiti）品系由贵州省烟草科学研究院分子遗传重点实验室提供。克隆载体pGEM T vector购自Promega公司，SuperScriptⅡ反转录酶、Trizol Reagent均为Invitrogen公司产品。引物合成及DNA测序委托上海杰瑞公司完成。

1.2 方法

1.2.1 金鱼草AmGT1基因的电子克隆 以已报道的白苏子（Perilla frutescens）花青素糖基转移酶cDNA序列（GenBank登录号：AB002818.1）为查询探针，对GenBank中EST_others数据库指定物种金鱼草（Antirrhinu mmajus）进行BLAST检索。利用DNAMAN6.0软件将检索到金鱼草的全部EST序列拼接，形成重叠群（contig）。然后用此重叠群再次进行同源检索拼接，重复以上步骤直至没有更多金鱼草的重叠EST检索出，最终获得金鱼草的花青素糖基转移酶cDNA序列片段。

1.2.2 金鱼草AmGT1基因引物序列设计 依据电子克隆的结果设计全长基因克隆引物（表1），引物序列如下：

1.2.3 金鱼草RNA的提取与反转录 使用TrizolReagent提取金鱼草叶片总RNA，操作参考说明书进行。

cDNA第一链的合成以总RNA样品1 μg为模板，采用OligodT-AdaptorPrimer进行反转录，反转录后产物即为总cDNA第一链。反转录按试剂盒说明书略加修改进行。反转录条件为：42 ℃ 40 min，50 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

1.2.4 金鱼草AmGT1基因的扩增 以反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系及程序如表2。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶检测。回收目的条带并与T-Vector连接，转化到感受态细胞DH5α中，筛选阳性克隆并送交测序。

1.2.5 金鱼草AmGT1基因的序列分析 利用在线的ORF finder软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）预测目的基因的开放阅读框并翻译成蛋白质，运用DNAMAN 6.0、ClustalX 2.0和MEGA 4.1软件进行蛋白质的亲水性预测、氨基酸序列比对和进化树分析。

1.3 实时荧光定量RT-PCR检测AmGT1基因表达水平

1.3.1 RNA提取及反转录 以红、粉、黄、白4种颜色的金鱼草（Antirrhinum ‘Tahiti）花朵为材料，分别取紧蕾期（Ⅰ花冠先端着色，未伸出花萼）、松蕾期（Ⅱ花冠伸出花萼、闭合）、初开期（Ⅲ花冠筒上唇开裂、下唇抱合）和盛开期（Ⅳ上唇直立，下唇展开）的花瓣进行总RNA提取，分析AmGT1基因在不同颜色花朵中的表达情况。以红花品种的根、茎和叶为材料分别提取总RNA，分析AmGT1基因在不同组织部位的表达特征。本试验所用RNA均经DNaseⅠ处理，除去DNA污染。利用Promega公司的MMLV反转录酶反转录生成cDNA。

根据目的基因序列和实时定量RT-PCR引物的设计原则设计引物。引物5′GCACCCTTACTCAC

CCTA3′/5′ACCTCTGTTCTCAGCCATA3′用来扩增目标基因，引物：5′TGGCATACATTGCTCTTG3′/5′TCATTGATGGCTGGAAAA3′用來扩增内参基因AmActin（HQ853640.1）。

1.3.2 金鱼草 AmGT1表达水平检测 实时定量RT-PCR用ABI公司的ViAA 7系统进行，每个试验3次重复，采用ΔΔCt法计算基因的相对表达量。测定根、茎、叶片表达量时，以红花金鱼草根AmGT1基因Ct值为对照组。测定不同花色中表达量时，以红花金鱼草花朵紧蕾期AmGT1基因Ct值为对照组。

2 结果与分析

2.1 金鱼草AmGT1全长基因的克隆

通过电子克隆和RT-PCR扩增，获得1条全长cDNA（图1）。序列分析表明，该基因全长892 bp，包含36 bp的5′UTR（Untranslated region），834 bp的ORF（Open reading frame）以及22 bp的3′UTR，编码一个277个氨基酸的蛋白质。这是金鱼草中克隆得到的第一个花青素糖基转移酶基因，将其命名为AmGT1，GenBank基因登录号KY417139。

2.2 金鱼草AmGT1全长序列及同源序列的进化分析

利用Conserved Domain Database（CDD）软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）对AmGT1所编码的氨基酸序列的保守结构域进行分析发现，该基因具有一个保守的GRX家族的结构域，属于GTB亚家族（图2）。该结果进一步证明了所克隆的基因为金鱼草的花青素糖基转移酶基因。

为了进一步分析AmGT1基因与其他物种花青素糖基转移酶基因的关系，用MEGA4.0软件将AmGT1基因与已报导的其他植物的花青素糖基转移酶基因构建了系统进化树。AmGT1的氨基酸序列与白苏子的同源性最高，为79%，与其他已经发现的GT蛋白的同源性在42%～62%之间，系统进化分析表明，AmGT1与白苏子及橘色沟酸浆的花青素糖基转移酶基因处于同一进化分支上（图3），表明三者在进化上更为保守。

2.3 金鱼草AmGT1在不同器官的表达水平检测

利用实时荧光定量PCR技术分析AmGT1基因的根、茎、叶组织的表达特性，结果见图4。由图4可以看出，AmGT1基因在金鱼草的根、茎、叶中均有表达，且在叶片中的表达量最高，而在根中的表达量最低，表明该基因的表达没有明显的组织特异性。

2.4 金鱼草AmGT1在不同花色中的表达水平检测

利用实时荧光定量PCR技术分析AmGT1基因在红、粉、黄、白4种花色金鱼草中的表达，结果见图5。由图5可以看出，AmGT1基因在金鱼草的红、粉、黄、白4种花色中均有表达，但表达量差异较大。AmGT1在红花金鱼草紧蕾期表达量较低，在松蕾期时跃变，迅速达到较高水平，之后一直保持较高水平。粉花金鱼草AmGT1表达变化趋势与红花金鱼草类似，但表达量远小于红花金鱼草。黄花金鱼草AmGT1松蕾期表达量比紧蕾期明显增加，但初开时表达量降低，盛开时再次升高。白花金鱼草AmGT1表达量一直处于较低水平，并呈逐渐降低趋势。

3 讨论

笔者以金鱼草为材料，依据近缘植物白苏子花青素糖基转移酶基因为探针，利用电子克隆的方法，通过GenBank完整EST数据库比对，获得了AmGT1基因全长序列。同时，利用RT-PCR确认AmGT1在金鱼草组织中表达，证明其与金鱼草花色苷合成相关。花青素是影响花色的主要次生代谢产物，被糖基化后以花色苷的形式存在并被保存在液泡中，不仅起到维持细胞代谢平衡的作用，在生命体急需时还可迅速调动。AmGT1基因的发现为未来深入研究金鱼草花色苷分子合成及调控机理，了解AmGT1酶活性，利用AmGT1基因改变植物的花色、培育金鱼草新品种提供依据。

一般认为花青素富含在花卉和彩色植物组织中。苹果、草莓和荔枝等呈红紫色植物组织中花色苷聚集，花青素糖基转移酶活性也较强[10]。王应丽等[11]研究发现箭叶淫羊藿GTs仅在红色品种的叶片中表达，而在绿色品种叶片中不表达或表达量很低，并指出GTs表达同花青素的積累呈正相关性。张洪伟等[12]通过研究不同皮色洋葱鳞茎、赵志常等[13]对不同颜色品种的芒果、李翔等[14]对紫长茄与圆白茄、肖继坪等[15]对彩色马铃薯等研究都得出了相似的结论。花青素糖基转移酶在不同植物中活性不同。同一株植物的不同组织部位，花青素糖基转移酶活性也不同。通常越稚嫩的部位，花青素糖基转移酶活性越高。本研究有类似发现，AmGT1在金鱼草根、茎、叶中均有表达，但相对表达量较低，这与金鱼草根、茎、叶中花青素含量较低有关；而AmGT1表达量叶片>茎>根，说明AmGT1存在明显组织表达差异性。AmGT1基因在红、粉、黄、白4种花色金鱼草中都有表达，但红色花的表达量显著高于其它颜色，白色花表达水平一直较低，这表明AmGT1是植物花朵呈现红色的重要基因。同一种颜色花朵，红花、粉花的表达量，中、后期（松蕾期、初开期、盛开期）显著高于前期；这个紧蕾期到松蕾期的跃变表明蕾期AmGT1的表达对花朵显色影响较大。

葡萄UF3GT在体外不仅能利用花青素类作为糖基受体，还能利用黄酮醇等化合物作为底物[16]；甜菊体内GTs既可以对类黄酮转糖基，同时还生成甜菊糖苷，不具有严格的底物特异性[17]。AmGT1表达是否具有底物特异性，对于利用基因工程改变金鱼草花青素相关基因表达，进一步研究该基因酶在生物体外以糖基化的形式存在并被保存，从而提高其保健价值具有重要意义，需进一步深入研究。

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