利用大肠杆菌全细胞催化赖氨酸发酵液生产1,5-戊二胺

齐雁斌，马伟超，陈可泉

（南京工业大学生物与制药工程学院，江苏 南京 211816）

利用大肠杆菌全细胞催化赖氨酸发酵液生产1,5-戊二胺

齐雁斌，马伟超，陈可泉

（南京工业大学生物与制药工程学院，江苏 南京 211816）

1,5-戊二胺是一种具有生物活性的生物胺。赖氨酸脱羧酶可以催化L-赖氨酸生产1,5-戊二胺。为了减少生产成本，本文利用大肠杆菌AST1以赖氨酸发酵液作为底物进行全细胞催化生产1,5-戊二胺。研究转化pH、菌体浓度、转化温度、磷酸吡哆醛（PLP）添加量以及不同酸种类对转化的影响，并对菌体的重复利用性进行了研究。在最优条件下：pH6.8、转化温度37℃、PLP添加量0.1mmol/L、菌体浓度（DCW）2.5g/L，用乙酸来调节转化过程pH，可以转化含有赖氨酸123.8g/L的发酵液，得到含有86.18g/L戊二胺的转化液，转化率可达到99.61%。并且菌体在赖氨酸发酵液中重复利用5次的情况下转化率可以达到50%以上，重复利用性明显比在赖氨酸溶液中转化时强，这极大程度地节约了生产成本，为1,5-戊二胺连续工业化生产打下了基础。

1,5-戊二胺；赖氨酸发酵液；全细胞转化；工业化生产

1,5-戊二胺（1,5-pentanediamine，简称戊二胺），即尸胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成的产物。在工业上是一种极为重要的化工原料，与己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合可分别形成新型材料聚酰胺5.6、聚酰胺5.4和聚酰胺5.10[1-3]。由于1,5-戊二胺具有多种生物活性及工业用途，所以具有较高的市场价值。

目前合成戊二胺的方法有化学合成法、酶转化法、微生物发酵生产法等[4-6]。化学合成法条件苛刻、污染环境；酶转化法过程复杂、成本较高；微生物直接发酵生产法虽相对生产原料成本较低，但直接发酵生产的戊二胺含量较低，且发酵液成分复杂，副产物多，产物的分离纯化比较困难。全细胞催化是介于发酵法和酶法之间的一种生物催化技术[7]。它结合发酵法和酶法的优势，利用这些优势，全细胞催化已应用于戊二胺等有毒物质生产中。MA等[8]在大肠杆菌中过表达PelB、CadB、CadA基因，通过对表达方式和转化条件的优化，最终使尸胺浓度达到221 g/L，转化率达到92 %；OH等[9]利用全细胞催化生产戊二胺，通过转化条件的优化，转化率达到99.9%。

本文利用大肠杆菌AST1进行全细胞催化赖氨酸发酵液生产1,5-戊二胺，通过对转化条件的优化，提高了转化率，并筛选能够多次重复利用的菌株，在减少赖氨酸加入的同时也为1,5-戊二胺的连续生产打下了基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

赖氨酸大肠杆菌工程菌株（E. coli NT1003），该菌株保存在中国典型培养物保藏中心（No. M 2013239）。赖氨酸脱羧酶大肠杆菌工程菌株（Escherichia coli AST1）由本实验室构建并保存。

1.2 培养基

平板培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠5，琼脂15，氨苄青霉素0.1，氯霉素0.068。

种子培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠5，氨苄青霉素0.1，氯霉素0.068。

初始发酵培养基（g/L）：葡萄糖 2，氯化铵 1，十二水合磷酸氢二钠17.1，磷酸二氢钾 3，氯化钠0.5，硫酸镁0.12，七水合硫酸亚铁 0.00028，氯化钙 0.011，乳糖 3，氨苄青霉素 0.1，氯霉素 0.068，微量元素混合液0.1%（体积比）。

微量元素混合液：(NH4)6Mo7O243×10–9mol/L，H3BO34×10–7mol/L，CoCl2·6H2O 3×10–8mol/L，CuSO4·5H2O 1×10–8mol/L，MnCl2·4H2O 8×10–8mol/L，ZnSO4·7H2O 1×10–8mol/L。

1.3 试剂与仪器

戊二胺纯品购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；丹磺酰氯购于Sigma公司；氨苄青霉素和氯霉素购于上海生工生物有限公司；NaCl、蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等购于南京晚晴化玻有限公司。

1.4 L级联发酵罐Mulitifor HT；高速冷冻离心机eppendorf 5810R；SBA-40E双通道生物传感仪；戊二胺浓度测定采用安捷伦1290液相色谱系统和安捷伦TC-C18色谱柱（4.6×250 mm）。

1.4 赖氨酸发酵液的制备

以大肠杆菌E. coli NT1003作为出发菌株，在7.5L发酵罐做补料分批发酵，发酵72h得到赖氨酸含量为123.8g/L的赖氨酸发酵液。详细步骤见参考文献[10]。

1.5 重组大肠杆菌 AST1产赖氨酸脱羧酶发酵培养

1.5.1 种子培养

从冻存甘油管里吸取菌液接种于液体种子培养基，37℃，200r/min培养6h。

1.5.2 发酵罐培养

按10%接种量将种子培养液转接至终体积为4L发酵罐培养基中，37℃培养，待OD600约为4～5时加入IPTG进行诱导，诱导培养12h后收集菌体。

1.6 全细胞转化生产1,5-戊二胺

全细胞转化方法参考文献[11]。

1.7 L-赖氨酸和1,5-戊二胺的测定

使用SBA-40E双通道生物传感仪测定L-赖氨酸浓度，戊二胺浓度测定采用安捷伦1290液相色谱系统和安捷伦TC-C18色谱柱（4.6×250mm）。柱温(40±1)℃，流速1.0mL/min; 进样量10μL；荧光激发波长为350nm，发射波长为520nm。紫外检测器波长250nm[12]。

1.8 转化条件对全细胞转化生产1,5-戊二胺的影响

在1.4L级联发酵罐上以赖氨酸发酵液作为底物进行全细胞转化，转化体系为500mL，首先选择适合在发酵液转化的宿主菌，然后分别考察转化温度、转化pH、菌体浓度、磷酸吡哆醛（PLP）添加量以及不同酸种类对转化的影响，并比较了菌株在发酵液中和赖氨酸溶液中的重复利用性。

2 结果与讨论

2.1 分别以赖氨酸发酵液和赖氨酸溶液作为底物转化

由于赖氨酸发酵液中成分比较复杂，里面的组成成分在一定程度上会对赖氨酸脱羧酶的酶活产生影响，因此本实验利用含有相同浓度的赖氨酸发酵液和赖氨酸溶液作为底物进行全细胞转化生产戊二胺，对比其转化效果，结果见图1。

由图1可以看出，在含有相同浓度赖氨酸的情况下，利用赖氨酸发酵液来作为底物生产戊二胺的全细胞转化速率比利用赖氨酸溶液为底物要快，这可能是由于赖氨酸发酵液中的一些物质可以提高赖氨酸脱羧酶的酶活。由此可以看出利用赖氨酸发酵液代替赖氨酸溶液作为底物进行全细胞转化生产戊二胺是可行的。

图1 赖氨酸发酵液和赖氨酸溶液在发酵过程中的浓度变化

2.2 转化温度对全细胞催化的影响

全细胞催化其本质是细胞内的酶参与催化反应。温度对酶活性的影响很大，温度过低会降低转化效率，而温度过高则可能会破坏酶的结构，使酶失活。因此，本实验考察不同温度对转化过程的影响，结果图2。

图2 温度对转化过程的影响

由图2可以看出，在25～37℃时，随着温度升高，戊二胺的浓度呈现出由低到高趋势，温度超过37℃时，1,5-戊二胺产量呈现出降低的趋势；而当转化温度为37℃时，全细胞转化速率快，转化3h后转化液中1,5-戊二胺的含量为42.06g/L，转化率达到49.08%。这是由于温度在酶反应最适温度附近变化时酶的活性也随之发生变化，但温度高于最适温度，酶的高级结构受到破坏，导致酶的活性降低[13]。因此，选择最适转化温度为37℃。

2.3 pH对全细胞催化的影响

酶促反应会受到pH的影响，酶在反应条件下，都有其最适的pH，在最适pH条件下，酶活性最高，低于或者高于最适pH，酶的活力都会出现一定程度下降。另外pH还会改变底物的解离状态，影响底物与酶的特异性结合[14]。本实验设置的pH梯度为2.0、3.0、4.0、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0，考察了转化过程中不同pH对转化的影响，结果如图3。

图3 pH对转化的影响

从图3中可以看出，当转化pH在5以下时催化效率非常低，戊二胺浓度不高；当pH超过6.8时戊二胺浓度开始降低，这说明过酸过碱都会对转化造成影响。当pH在5～6.8之间时催化效率较高，戊二胺浓度也较高，说明酶在此pH区间活性较高；这与文献[15-16]中报道的适宜pH相符，其中当pH值为6.8时戊二胺产量最高，在转化3h后转化液中戊二胺的含量可以达到54.76g/L，转化效率达到63.28%，因此本实验确定最佳初始pH为6.8。

2.4 菌体浓度对全细胞催化的影响

由于本实验全细胞转化所用的赖氨酸脱羧酶属于胞内酶，故菌体量与酶量具有正相关，由于在酶促反应过程中酶量较少会造成底物抑制，酶量过多则会造成浪费，因此在反应中选择合适的酶量具有很大意义。本实验考察菌体浓度对转化过程的影响，结果如图4。

由图4可知，当菌体浓度（DCW）在1～2.5g/L之间时随着菌体浓度的增大，转化液中戊二胺的含量也在不断增加。当菌体浓度（DCW）为3g/L时，酶的催化速率较高，但与菌体浓度（DCW）2.5g/L相比单位时间内产物增加量不是很明显。因此本实验确定最适菌体浓度（DCW）为2.5g/L。转化3h后转化液中戊二胺的含量为73.19g/L，转化率达到86.23%。

图4 菌体浓度对转化过程的影响

2.5 磷酸吡哆醛的添加量对全细胞催化的影响

磷酸吡哆醛（PLP）可以参与氨基酸的转氨和脱酸反应，是氨基酸代谢过程的辅酶，在脱羧反应中添加PLP可以促进酶的催化速率。因此，本实验考察了添加不同浓度的PLP对戊二胺生产的影响，结果如图5。

图5 PLP浓度对戊二胺生产的影响

由图5可以看出，添加磷酸吡哆醛（PLP）可以明显地提高转化效率，当PLP添加量在0～0.1mmol/L之间时随着PLP添加量的加大，转化液中戊二胺的含量也在逐渐增加，当PLP添加量高于0.1mmol/L时转化液中戊二胺含量并没有明显增加，因此本实验确定PLP最适添加量为0.1mmol/L，在此添加量下戊二胺浓度可达到81.26g/L，转化率可达到93.9%。

2.6 不同酸种类对全细胞催化的影响

由于戊二胺呈碱性，因此在全细胞转化产戊二胺的过程中需要加入大量的酸来中和，从而保证赖氨酸脱羧酶在适宜的pH下进行催化反应。由于不同酸对细胞的损伤程度不同，且一些酸挥发性较强，不易于进行实验操作。因此本实验通过利用不同酸来中和生产过程中产生的戊二胺，考察不同种类的酸对细胞损伤程度以及对转化效率的影响。

由图6可以看出，当选择乙酸、丁二酸和己二酸来中和戊二胺时，转化液中戊二胺的含量较高且转化后菌体损失较少，但是由于丁二酸和己二酸溶解度较低，故在实验中需要加入固体颗粒，这使得操作变得复杂，不利于生产的进行。而在使用甲酸进行中和时，转化液中戊二胺的含量与前三种有机酸相比较低，且菌体量损失相对较多，这可能是由于甲酸具有强氧化性和腐蚀性，对菌体伤害较重。而在使用无机酸中和戊二胺的过程中，浓盐酸挥发性较强，不利于实验操作；而硫酸腐蚀性较强对菌体伤害较大且易腐蚀容器；磷酸相对与浓盐酸和浓硫酸更有利于戊二胺的生产。综合来看在转化过程中利用乙酸来调节pH较为合适，转化3h后转化液中戊二胺的含量可达到86.18g/L，转化率可达到99.61%。

图6 不同种类的酸对细胞损伤程度以及对转化效率的影响

2.7 菌株重复利用性的考察

由于全细胞催化是与菌体量有关的生物催化技术，因此在生产过程中需要收集菌体。如果菌体可以重复利用且保持很高的转化效率，那么生产工艺将得到简化，也能在一定程度上节约生产成本。因此本次实验在上述最优条件下利用同一批菌体分别以赖氨酸发酵液和赖氨酸溶液为底物连续转化6次，对比其重复利用的性能。

由图7可以看出，菌体在两种溶液中进行1次转化时均能得到较高的底物转化率，其中在赖氨酸发酵液中其底物转化效率可以达到99.61%，在赖氨酸溶液中其底物转化率可以达到99.52%。但是随着转化次数的增加，菌体在两种溶液中的底物转化率都在降低。而当以赖氨酸溶液作为底物时，其底物转化率降低的比较快，在经过3次重复利用后底物转化率就降到了50%以下。而当以赖氨酸发酵液为底物进行时，其重复利用性能明显增强，在经过5次重复利用时其转化效率还能够达到52%。这可能是赖氨酸发酵液中含有甜菜碱等物质，可以保护细胞内的蛋白和酶的活性[17]。

图7 菌株的重复利用性

3 结论

本实验利用大肠杆菌全细胞催化赖氨酸发酵液生产1,5-戊二胺，通过对其催化条件进行优化，在最优条件：转化pH6.8、转化温度37℃、PLP添加量0.1mmol/L、菌体浓度（DCW）2.5g/L；用乙酸来调节转化过程pH，可以转化含有赖氨酸123.8g/L的发酵液，得到含有86.18g/L戊二胺的转化液，底物转化率可达到99.61%。并且菌体在发酵液中重复利用5次的情况下底物转化率依然可以达到50%以上，重复利用性明显比在赖氨酸溶液中转化时强，这极大地节约了生产成本，为1,5-戊二胺连续工业化生产打下了基础。

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1,5-pentanediamine production by using Escherichia coli whole-cell biocatalysis lysine fermentation liquid

QI Yanbin，MA Weicao，CHEN Kequan
（Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816，Jiangsu，China）

1,5-pentanediamine is a bioactive biogenic amine. L-lysine decarboxylase can catalyze with L-lysine to produce 1,5-pentanediamine. To reduce the production cost，whole cell catalytic production of 1,5-pentanediamine was outperformed using Escherichia coli AST1 and with lysine fermentation broth as the substrate. The effects of transformation pH，cell concentration，transformation temperature，PLP addition amount，and different kinds of acid on the transformation and the reusability of the cells were investigated. At the optimal condition，0.1mmol/L PLP，2.5g/L DCW and pH as 6.8，37℃，86.18g/L of 1,5-pentanediamine was obtained by transforming the fermentation broth containing 123.8 g/L L-lysine，and adjusting the pH using the acetic acid during conversion process. Furthermore，the cells can be reused five times and the substrate conversion rate maintained above 50% in the lysine fermentation broth. The reusability was better than that in the lysine solution，which greatly reduces the production cost and lays a foundation for 1,5-pentanediamine commercial production.

1,5-pentanediamine；lysine fermentation liquid；whole-cell biocatalysis；commercial process

TQ033

：A

：1000–6613（2017）05–1843–05

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.05.036

2016-10-11；修改稿日期：2016-12-21。

国家自然科学基金（21390200，31440024）、国家重点基础研究发展计划（2011CBA00807）及国家高技术研究发展计划（2014AA021703）项目 。

齐雁斌（1993—），男，硕士研究生，主要研究微生物代谢与发酵。E-mail：18260037163@163.com。联系人：陈可泉，博士，副教授，主要从事生物过程工程与系统工程领域的研究工作。E-mail：kqchen@njtech.edu.cn。