1-羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲/氧化石墨烯纳米材料制备及其抗菌性能

宋少波，张华，付海丽，张雯，李伟

（天津工业大学省部共建分离膜与膜过程国家重点实验室，天津 300387）

1-羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲/氧化石墨烯纳米材料制备及其抗菌性能

宋少波，张华，付海丽，张雯，李伟

（天津工业大学省部共建分离膜与膜过程国家重点实验室，天津 300387）

通过接枝改性氧化石墨烯（GO）制备了1-羟甲基-5，5-二甲基乙内酰脲/氧化石墨烯（1-MDMH/GO）纳米材料。利用FTIR、XRD、XPS、SEM和AFM等方法对1-MDMH/GO纳米材料的结构和性能进行了表征。分别用金黄色葡萄球菌（S. cereus）和大肠杆菌（E. coli）为模拟体系对纳米复合物的抗菌性进行检验，通过抑菌环和平板计数法测定复合物的抗菌性能。结果显示：1-羟甲基-5，5-二甲基乙内酰脲（1-MDMH）成功地接枝到GO上，并且得到的GO和1-MDMH/GO皆为片状结构组成的二维单层纳米材料，具有大的比表面积，其中1-MDMH/GO复合物的层间距较GO增大0.124nm。细菌与复合物接触24h后，1-MDMH/GO对S. cereus的抗菌率为97.9%，对E. coli的抗菌率为92.4%。较之GO，相同条件下其对上述两种细菌有更好的抑制能力，抗菌率分别提高了25.0%和33.3%。

氧化石墨烯；卤铵盐；协同作用；抗菌；纳米材料

石墨烯具有大的比表面积、优异的电学、力学、热学和光学性质以及稳定的化学性能等特点，是近年来发现的一种新型材料[1-5]。2010年，上海应用物理所HU等[6]首次发现了石墨烯材料的抗菌作用，立即引起了科学界的广泛兴趣。进一步研究其抗菌机理，结果表明其尖锐的边缘对大肠杆菌细胞膜具有破坏作用[7-9]。这种物理抗菌机理表明其抗菌过程中细菌不易产生抗药性[10-13]，表明石墨烯是一种具有广阔前景的新型抗菌材料。但是其抗菌范围（抗菌广谱性）受到限制，对其进行化学改性可进一步提高其抗菌性能。

抗菌剂[14-15]种类繁多，其中以1-羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲（1-MDMH）为代表的高分子卤铵盐[16]抗菌剂具有抗菌广谱性、低毒性、便于改性等优点使其备受青睐[17-18]。但其单独使用时抗菌药用剂量大，不宜直接被固载在各种材料上。把卤胺抗菌剂和纳米技术有机结合，有望应用在功能纤维、水消毒、涂料、医疗卫生等领域。

JIANG等[19]将纳米银颗粒负载到氧化石墨烯（GO）上制备出了GO-Ag复合材料，进一步研究表明石墨烯能够吸附在细菌细胞表面，使纳米银能容易地进入细胞内，进一步提高杀菌性能；MARTA等[20]将壳聚糖、纳米银和GO制备形成新型复合物，三者协同的抗菌性能远高于单一的GO。本研究通过GO与1-MDMH间反应制备了具有良好抗菌性能的1-MDMH/GO复合材料，并对复合材料的微观结构和性能进行了表征。通过对GO的改性，进一步提高其抗菌性能，有效地扩展了石墨烯的应用领域。

1 实验部分

1.1 实验试剂

1-羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲（1-MDMH）、4-二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺，购自日本东京化成工业株式会社；次氯酸钠为分析纯，天津市福晨化学试剂厂；二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺均为分析纯，天津市光复科技发展有限公司；石墨粉（Gt，粒径=320目），购自阿拉丁；蛋白胨、酵母浸膏粉和琼脂粉均为生化试剂，天津市光复精细化工研究所；金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）由天津医科大学提供。

1.2 实验过程

1.2.1 GO的制备

将40mL浓硫酸加入到250mL的三口烧瓶中，加热至90℃，机械搅拌，同时加入4g五氧化二磷和4g过硫酸钾，将温度降至80℃，再加入5g Gt。恒温反应4.5h，冷却至室温，加入200mL蒸馏水，静置过夜，过滤，烘干，即可得到预氧化石墨。

将250mL三口烧瓶置于冰水浴中，加入57.5mL浓硫酸，机械搅拌，加入0.5g硝酸钠和2.5g预氧化石墨片，待固体溶解后，缓慢加入5g高锰酸钾，反应30min，再升温至35℃反应90min。最后加入350mL蒸馏水升温至95℃，反应15min，将反应物转移至2000mL的烧杯中，滴加12.5mL 30%的过氧化氢溶液，过滤，得到枯黄色固体，加入10mL 10%稀盐酸洗涤，离心，冷冻干燥。

1.2.2 1-MDMH/GO的制备

称取0.1g GO置于250mL烧杯内，加入150mL二氯甲烷，超声振荡40min，再将上述溶液转移于250mL三口烧瓶中并加入1g 4-二甲氨基吡啶、0.1g二环己基碳二亚胺与0.3g 1-MDMH，迅速放入恒温60℃的水浴锅中，氮气保护，搅拌，反应12h。除去上层清液，洗涤，再用10mL次氯酸钠溶液浸泡，洗涤，抽滤，冷冻干燥。

1.3 性能测试与表征

采用德国Bruker Uecior 22傅里叶变换红外光谱仪对GO和1-MDMH/GO样品从4000～400cm–1进行扫描。采用日本Rigaku公司D/MAX 2500型X射线衍射仪（XRD）测试样品层间距，使用Cu靶辐射源（λ=0.154nm），Ni滤波片，扫描范围4°～80°，扫描速率0.1°/s，管电压 50kV，管电流35mA。将样品精细研磨，然后加入到样品板孔里，采用岛津/Kratos的X光电子能谱仪AXIS Supra测试表面C、N、O的含量。采用日本日立公司Hitachi S-4800型扫描电镜（SEM）对样品表面的形貌进行观察。AFM是将事先准备好的1-MDMH/GO在乙醇溶液中分散，用微量的注射泵取样，然后滴到云母片上，置于红外灯下进行干燥，采用美国SPM-5500型原子力显微镜扫描样品的表面结构。

1.4 抗菌性能

1.4.1 抑菌环

将GO和1-MDMH/GO两种物质压片，采用抑菌圈法测定两种物质的抗菌性。无菌条件下，每组制作3个平行固体培养基，将S. cereus和E. coli置于固体培养基中37℃下培养24h后，通过观察抑菌圈的大小判断抗菌剂的抗菌能力。

1.4.2 平板计数法

取5支已灭菌的离心管，分别加入20mL培养液与浓度约为107cfu/mL的S. cereus或E. coli菌悬液，再分别向后4支离心管中加入GO、1-MDMH/GO、氨苄青霉素（阳性对照）、磷酸盐缓冲液（PBS阴性对照，pH=7.4）各0.1g，培养24h后，分别逐级稀释，对不同混合物的试液，选取3个不同浓度梯度菌液各0.2mL分别铺平板，在37℃固体培养基下培养24h后，进行平板计数，从而得到各试液的活菌数（平行3组实验），抗菌率按式(1)计算。

1.4.3 电镜观察

分别称取0.1g GO与1-MDMH/GO，再分别加入20mL菌悬液浓度为107cfu/mL 的S. cereus和E. coli液体培养液，于37℃恒温摇床中振荡24h后取出离心，倾去上层清液，用2.5%戊二醛固定，再用不同浓度梯度的乙醇溶液逐级洗脱，干燥，喷金，用SEM观察。

2 结果与讨论

2.1 1-MDMH/GO的化学组成

图1为GO和1-MDMH/GO的红外光谱图。如图所示：a，b两曲线在3430cm–1、1650cm–1、1100cm–1、1050cm–1处出现O－H、C==C、C(O)O、C－C伸缩振动峰，它们属于GO的特征吸收峰。相较与曲线a，曲线b在1712cm–1处出现N—H的伸缩振动吸收峰和1340cm–1、1280cm–1处出现的C－N伸缩振动吸收峰，这些特征峰都属于1-MDMH/GO的特征振动吸收峰，并且在1775cm–1处出现C==O的伸缩振动峰，表明GO成功接枝到了1-MDMH上。

2.2 1-MDMH/GO的晶体结构

图2为GO和1-MDMH/GO的X射线衍射图。如图所示：与曲线a在2θ=10.7°处（d=0.826nm）出现一个很强的特征衍射峰相比，曲线b上（002）晶面特征衍射峰出现在2θ=9.3°处（d=0.950nm），图形向左移动，表明界面间距得到增大，增大了0.124nm。这是因为通过酯化反应1-MDMH成功地接枝到了GO的表面，使得其层间距进一步增加。

图1 GO和1-MDMH/GO的傅里叶变换红外光谱图

图2 GO和1-MDMH/GO的X射线衍射谱图

2.3 1-MDMH/GO的表面组成

图3为GO和1-MDMH/GO的X射线光电子能谱图。如图3(a)所示，GO结合能在284.4eV和531.5eV处分别出现了碳峰和氧峰，这是因为经过修正Hummers法制备得到的GO上存在大量的氧化基团如羟基、羧基等。与图3(a)相比，图3(b)在结合能398.8eV处出现的氮峰属于接枝反应物1-MDMH，也进一步说明1-MDMH/GO制备成功。与GO中的氧含量相比，1-MDMH/GO中的氧含量由28.1%增加到35.5%，主要原因是GO表面上的羧基反应成了酯基，氧化程度得到进一步的增大，另一个原因是因为1-MDMH高的含氧量，也使1-MDMH/GO的含氧量上升。

2.4 1-MDMH/GO的表面形貌

图4为Gt、GO以及1-MDMH/GO的扫描电镜图。如图所示： Gt片层堆积严重，表面平整；GO经过高温氧化片层变薄，表面出现明显褶皱；而通过接枝后，1-MDMH/GO表面形貌发生变化，褶皱更加明显并且出现一些小凸起。更多的褶皱会使其层间距变大，和XRD数据相对应。

2.5 1-MDMH/GO的微观形貌

图3 GO和1-MDMH/GO的X射线光电子能谱图

图4 Gt、GO以及1-MDMH/GO的扫描电镜图

图5 GO以及1-MDMH/GO的原子力显微镜图

图5为GO与1-MDMH/GO原子力显微镜照片。由图5(a)中可以看出GO为片状单层结构，片层厚度为0.9nm，半径大于2μm，说明具有大的比表面积的单层GO已制备成功。由图5(b)可以看出1-MDMH/GO亦为片状单层结构且较GO的片层厚度增加，增加至1.1nm，这是因为 1-MDMH接枝到GO上的原因。而1-MDMH/GO片层半径较GO的半径有所减小，这是因为接枝反应过程中GO边缘被破坏。

2.6 抗菌性能

图6是GO和1-MDMH/GO对S. cereus和E. coli的抑菌圈照片。由图6可见：GO对S. cereus和E. coli的抑菌圈均不及1-MDMH/GO的抑菌圈明显，表明1-MDMH与GO复合后，起到了协同抗菌的作用，提高了复合物的抗菌性能。其中1-MDMH/GO对S. cereus的抑菌圈直径大于E. coli的抑菌圈直径，这是因为S. cereus更薄的细胞壁更容易被刺破而失去活性。

从表1数据看出，GO和1-MDMH/GO两种物质与两种细菌接触24h后，GO对S. cereus的抑菌率可达78.3%，对E. coli的抗菌率可达69.3%，而1-MDMH/GO对两者的抗菌率分别为97.9%和92.4 %，说明1-MDMH/GO协同作用具有更好的抗菌效果。

2.7 1-MDMH/GO复合材料抗菌观察

图7(a)为正常的S. cereus照片，图7(d)为正常的E. coli，分别呈现球形和棒状，细菌边界较清晰。图7(b)和图7(e)分别为S. cereus和E.coli与GO接触24h后的扫描电镜照片，由图7(b)可以看到S. cereus部分被GO包覆发生了变形。而图7(e)可以看出在与GO接触24h后，E.coli表面开始发生凹陷。图7(c)和图7(f)分别为S. cereus和E. coli与1-MDMH/GO接触24h后的扫描电镜照片。可看出S. cereus开始出现聚集及融合，且边界逐渐模糊，而E. coli与复合物接触24h的扫描电镜照片，菌体已发生严重的变形和皱缩，部分细菌粘连在一起，已失去原有形态。上述情况的出现表明复合材料协同抗菌比单一GO的抗菌性更强，对细菌细胞壁有更好的刺破能力，使得细胞壁被破坏，细胞质流出，使细菌失去活性。

表1 GO 和 1-MDMH/GO 的抑菌率（n=3）

图6 GO和1-MDMH/GO对S. cereus和E. coli的抑菌圈

图7 1-MDMH/GO处理前、后S. cereus和E. coli的电镜照片

3 结论

（1）通过接枝改性GO成功制得1-MDMH/GO纳米材料，而1-MDMH/GO纳米材料表面产生形貌变化，出现大量凸起。

（2）电镜照片表明所制得的1-MDMH/GO较GO纳米材料的粒径尺寸降低，但1-MDMH/GO纳米材料层间距比GO增大0.124nm。

（3）1-MDMH/GO对S. cereus的抗菌率可达97.9%，对E. coli的抗菌率为92.4%。较之GO，其细菌抑制能力分别提高了25.0%和33.3%。

[1] 张力，吴俊涛，江雷. 石墨烯及其聚合物纳米复合材料[J]. 化学进展，2014，26（4）：560-571. ZHANG L，WU J T，JIANG L. Graphene and its polymer nanocomposites[J]. Progress in Chemistry，2014，26（4）：560-571.

[2] NOVOSELOV K S，GEIM A K，MOROZOV S V，et al. Electric field effect in atomically thin carbon film [J]. Science，2004，306（5696）：666-669.

[3] KIM K S，AHN J H，KIM P，et al. Large-scale pattern growth of grapheme films for stretchable transparent electrodes[J]. Nature，2009，457（7230）：706-710.

[4] DIKIN D A，ZIMNEY E J，PINER R D，et al. Preparation and characterization of graphene oxide paper[J]. Nature Letters，2007，448（7152）：457-460.

[5] 肖淑娟，于守武，谭小耀. 石墨烯类材料的应用及研究进展[J]. 化工进展，2015，34（5）：1345-1348. XIAO S J，YU S W，TAN X Y. Research progress and the applications of graphene materials[J]. Chemical Industry and Engineering Progress，2015，34（5）：1345-1348.

[6] HU W B，PENG C，LUO W J，et al. Graphene -based antibacterial paper[J]. ACS Nano，2010，4（7）：4317-4323.

[7] 张金超，杨康宁，张海松，等. 碳纳米材料在生物医学领域的应用现状及展望[J]. 化学进展，2013，25（2）：397-408. ZHANG J C，YANG K N，ZHANG H S，et al. Application status and prospect of carbon-based nanomaterials in biomedical field[J]. Progress in Chemistry，2013，25（2）：397-408.

[8] AKHAVAN O，GHADERI E. Toxicity of graphene and graphene oxide nanowalls against bacteria[J]. ACS Nano，2010，4（10）：5731-5736.

[9] AKHAVAN O，GHADERI E. Escherichia coil bacteria reduce graphene oxide to bactericidal graphene in a self-limiting manner[J]. Carbon，2012，50（5）：1853-1860.

[10] LIU S，ZENG T H，HOFMANN M，et al. Antibacterial activity of graphite，graphite oxide，graphene oxide and reduced graphene oxide：membrane and oxidative stress[J]. ACS Nano，2011，5（9）：6971-6980.

[11] LIU S，HU M，ZENG T H，et al. Lateral dimension-dependent antibacterial activity of graphene oxide sheets[J]. Langmuir，2012，28（33）：12364-12372.

[12] KNISHNAMOORTHY K，VEERAPANDIAN M，ZHANG L H，et al. Antibacterial efficiency of graphene nanosheets against pathogenic bacteria via lipid peroxidation[J]. The Journal of Physical Chemistry C，2012，116（32）：17280-17287.

[13] GURUNATHAN S，HAN J W，DAYEM A A，et al. Antibacterial activity of dithiothreitol reduced graphene oxide[J]. Journal of Industrial and Engineering Chemistry，2013，19（4）：1280-1288.

[14] 左华江，温婉华，吴丁财，等. 高分子抗菌剂的研究现状[J]. 化工进展，2013，32（3）：604-609. ZUO H J，WEN W H ，WU D C，et al. State-of-the-art of antibacterial polymers[J]. Chemical Industry and EngineeringProgress，2013，32（3）：604-609.

[15] 张昌辉，谢瑜，徐旋. 抗菌剂的研究进展[J]. 化工进展，2007，26（9）：1237-1242. ZHANG C H，XIE Y，XU X. Research and development of antibacterial agent[J]. Chemical Industry and Engineering Progress，2007，26（9）：1237-1242.

[16] 陈燕燕，李明春，辛梅华，等. 海因改性N-季铵化壳聚糖衍生物的合成及其抗菌性能[J]. 化工进展，2015，34（1）：188-192. CHEN Y Y，LI M C，XIN M H，et al. Synthesis and antibacterial research of hydantoin modified quaternary ammonium chitosan[J]. Chemical Industry and Engineering Progress，2015，34（1）：188-192.

[17] LI C，SUN R，ZENG Q Y，et al. Preparation and antimicrobial mechanism of organic polymeric biocides[J]. Polymer Bulletin，2011（3）：79-85.

[18] LI Q M，QIU F G，ZANG M，et al. Study on preparation and property of PAN-based activated carbon fiber felt[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni，2007，46（B06）：267-269.

[19] JIANG B，TIAN C，SONG G，et al. A novel Ag/graphene composite：facile fabrication and enhanced antibacterial properties[J]. Journal of Materials Science，2013，48（5）：1980-1985.

[20] MARTA B，POTARA M，ILIUT M，et al. Designing chitosan-silver nanoparticles-graphene oxide nanohybrids with enhanced antibacterial activity against Staphylococcus aureus[J]. Colloids and Surfaces A：Physicochemical and Engineering Aspects，2015，487：113-120.

Preparation and antibacterial activity of 1-hydroxy methyl-5，5-dimethylhydantoin/graphene oxide nanocomposites

SONG Shaobo，ZHANG Hua，FU Haili，ZHANG Wen，LI Wei
（State Key Laboratory of Separation Membranes and Membrane Processes，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

By grafting modification of graphene oxide on the reaction，we prepared 1-hydroxy methyl-5,5-dimethylhydantoin/graphene oxide（1-MDMH/GO）nanomaterial. The structure and properties of 1-MDMH/GO was analyzed with Fourier transform infrared spectrophotometer，X-ray diffraction spectroscopy，X-ray photoelectron spectroscopy，scanning electron microscope and atomic force microscope. The antibacterial property of compound was separately tested using Staphylococcus aureus（S. cereus）and Escherichia coli（E. coli）as model system and analyzed by using bacteriostatic ring and plate count methods. The results showed that，1-hydroxy methyl-5，5-dimethylhydantoin was successfully grafted onto the graphene oxide（GO）and 1-MDMH/GO and GO were of single-layer nanosheet structure with large specific surface. The layer spacing of the composite was increased by 0.124nm compared with GO. After being contacted with the two bacteria for 24h，the bacteriostatic rate of the 1-MDMH/GO reached 97.9% for S. cereus and 92.4% for E. coli，which had enhanced by 25.0%and 33.3% respectively，compared with GO under the same condition.

graphene oxide（GO）；ammonium halide；synergistic effect；antimicrobial；nanomaterials

TB34

：A

：1000–6613（2017）05–1831–07

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.05.034

2016-09-20；修改稿日期：2017-01-11。

国家自然科学基金（51573135）、省部共建分离膜与膜过程国家重点实验室（天津工业大学）开放课题（Z2-201560）及天津市高等学校科技发展基金（20140305）项目。

宋少波（1990—），男，硕士研究生，研究方向为纳米材料。联系人：张华，教授，硕士生导师，研究方向为纳米材料。E-mail：hua1210@126.com。