同位素内标液相色谱-串联质谱法测定婴儿配方奶粉中雌二醇残留

2017-05-15 02:12
中国乳品工业 2017年3期
关键词:雌二醇串联乙腈

(上海市质量监督检验技术研究院,上海200233)

同位素内标液相色谱-串联质谱法测定婴儿配方奶粉中雌二醇残留

杨晋青,虞成华,薛峰,秦宇,王磊,刘洋

(上海市质量监督检验技术研究院,上海200233)

建立了一种婴儿配方奶粉中雌二醇残留的高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定方法。样品经乙腈提取、浓缩、正己烷净化,用高效液相色谱分离后,采用电喷雾串联质谱进行定性和定量检测。线性范围为5~100 ng/mL,线性相关系数r大于0.99,方法的定量检出限为1.0 μg/kg(S/N=10),高、中、低3个水平的加标回收率为81.5%~112.4%。

高效液相色谱;串联质谱;婴儿配方奶粉;雌二醇

0 引言

雌激素是一类可直接影响动物代谢和繁殖,具有相似化学结构的类固醇激素。该类物质进入机体后,可激活和抑制内分泌系统功能,造成机体代谢调控紊乱,甚至可导致发育异常或肿瘤等[1-2],被欧盟等国在食用性动物饲养中列为禁用品[3]。目前,雌激素的残留检测研究主要集中在水产品、人血清、饮用水等[4-12],在婴幼儿奶粉中鲜见报道。婴幼儿奶粉作为婴儿除母乳外唯一的食物来源,其安全性对婴幼儿的健康至关重要[13]。

本文针对应用最广泛的类固醇激素——雌二醇,建立其在婴幼儿奶粉中的检测方法。采用高效液相色谱-串联质谱仪,在已有标准与文献研究基础上,优化了提取净化条件,利用同位素内标法进行定量,建立了婴幼儿配方奶粉中雌二醇残留的确证方法。为实现婴幼儿奶粉中雌二醇残留监控,保障婴幼儿奶粉的质量安全提供技术支撑。

1 实验

1.1 材料与试剂

试剂:甲醇,乙腈,乙酸乙酯,正己烷,均为色谱纯;氨水(分析纯),水为符合GB/T 6682规定的一级水(Milli-Q Synthesis超纯水系统制备)。

标准品:雌二醇(CAS号:50-28-2)纯度≥99.0%;雌二醇-13C2(100 μg/mL溶于乙腈中),于-20℃保存。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪,三重四级杆串联质谱仪,NH2固相萃取小柱(500 mg,3 cc);其他设备包括超声仪,旋转蒸发仪,Vortex Genius 3型漩涡混合器,离心机。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 标准储备溶液的配制

准确称取10.0 mg的雌二醇标准品于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,制备成质量浓度为1 000 mg/L标准储备液。-18℃避光保存备用。临用前标准储备液用甲醇稀释成质量浓度为100 ng/mL的标准工作液;雌二醇-13C2则配制成质量浓度为1 mg/L的内标工作液。

1.3.2 基质混合标准工作曲线溶液配制

吸取不同体积标准储备溶液,用空白样品提取液配成不同质量浓度(ng/mL)的基质混合标准工作溶液,现配现用。

1.4 仪器条件

1.4.1 超高效液相色谱条件:

色谱柱:C18高效液相色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18)。流动相:A为0.1%氨水溶液,B为乙腈,梯度洗脱步骤如表1所示;流速为0.2 mL/min;柱温为30℃;进样体积为10 L。

表1 梯度洗脱步骤

1.4.2 质谱条件

离子源为ESI源;扫描方式为负离子;气帘气为20 L/min;GS1为30 L/min;GS2为20 L/min;辅助加热气温度为400℃;喷雾电压为-4500 V;碰撞气为高纯氮气(≥99.999%);数据采集模式为MRM。定性定量离子对、碰撞能量等参数如表2所示,MRM结果如图1所示。

表2 雌二醇的质谱参数

1.4.3 液相色谱-串联质谱确证

定性测定:被测物质组分选择1个母离子,2个子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间与标准溶液中的标准物质的保留时间偏差在±2.5以内;且样品图谱中待测组分定性离子的相对丰度接近标准溶液图谱中对应的定性离子的相对丰度,若偏差不超过表3所规定的范围,则可判定样品中存在对应的待测物。

表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

定量测定:在仪器的最佳工作条件下,分别测定样品和标准溶液中雌二醇的峰面积,以内标标准曲线法进行定量计算。

图1 雌二醇标准品的多反应监测图

图2 雌二醇标准品的碰撞诱导解离质谱图

1.5 样品前处理方法

1.5.1 提取

称取5 g奶粉试样,精确至0.01 g,置于50 mL离心管中,加入适量内标标准工作溶液,使其最终定容浓度均为10 ng/mL。加入10 mL水溶解,再加入25 mL乙腈,涡旋1 min,超声10 min,然后加入5 g NaCl,振摇2 min,以10 000 r/min离心5 min后,以10 000 r/min离心5 min。上清液倒入100 mL鸡心瓶中,残渣再加入15 mL乙腈,重复上述操作一次。合并提取液,置于旋转蒸发仪上,在45℃水浴中真空浓缩至干,准确加入2 mL乙腈水溶液(2+8)溶解残渣(用于液液萃取净化);准确加入2 mL二氯甲烷-甲醇溶液(7+3)溶解残渣(用于固相萃取净化)。

1.5.2 净化

1.5.2.1 液液萃取净化

将上述溶液转移至5 mL离心管中,加入1 mL正己烷,涡旋1 min,以4 000 r/min离心10 min。取下层清液,过0.22 μm滤膜后,用液相色谱-串联质谱仪测定。按上述操作步骤制备样品空白提取液。

1.5.2.2 固相萃取净化

用6 mL二氯甲烷-甲醇溶液(7+3)活化平衡小柱,取备用液上样,控制流速不超过1滴/s;用10 mL二氯甲烷-甲醇溶液(7+3)洗脱,收集洗脱液,用微氮气流吹干,用1.0 ml乙腈-水溶液(1+9)超声溶解残渣,漩涡混匀,过0.22 μm滤膜后,用液相色谱-串联质谱仪测定。按上述操作步骤制备样品空白提取液。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

实验分别考察了Waters XbridgeTMC18和Agilent ZORBAX SB-C18两根色谱柱在乙腈-水和甲醇-水两种流动相洗脱下的分离效果。实验表明,雌二醇在两根C18柱的保留行为差别不大,采用甲醇-水体系作为流动相时易产生拖尾;考虑到节约成本和液相仪器的匹配问题,最终选用了Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18作为实验用柱。同时,分别比较了水/甲醇,水/乙腈,0.1%氨水溶液/甲醇,0.1%氨水溶液/乙腈,2 mM乙酸铵/乙腈这几种流动相对目标化合物离子化程度的影响,研究结果表明,采用0.1氨水溶液与乙腈作为流动相洗脱,获得了理想的峰形,质谱信号最强。若在流动相中添加醋酸铵会使信号降低,这可能离子源中离子浓度过高会抑制雌二醇的电离,从而导致离子化效率下降的缘故。

2.2 质谱条件的优化

雌二醇具有一定的弱极性或中等极性,选择电喷雾(ESI)离子源分别在正离子、负离子模式下进行母离子全扫描,对比两种模式,得出雌二醇负离子模式的离子峰强度比正离子峰强度高很多。而且其分子结构中含有酚羟基,因此选择负离子模式检测,首先进行一级母离子全扫描,确定其母离子,再用子离子扫描方式进行二级质谱扫描分析,,选择丰度相对较高、质荷比较大的两个特征离子碎片分别作为定量离子和辅助定性离子。通过优化离子化电压、离子源温度、雾化气、辅助加热气、气帘气,碰撞能量、去簇电压等质谱参数,使雌二醇的母离子与特征碎片子离子的离子对强度达到最大。结果表明:雌二醇在负离子化模式下易形成一级特征离子峰[M-H]-271.0(m/z)和很强的二级特征离子峰为182.8(m/z),具体的二级特征离子峰见图2。

实验中使用HPLC-MS/MS测定时有基质抑制效应存在.用阴性奶粉经过提取、净化定容后配制的标准溶液和直接配制的同浓度标准溶液相比,信号下降30%左右,从而直接导致回收率偏低.为了补偿由于基质抑制效应导致的测定数值偏差问题,采用基质匹配曲线(Matrix matched calibration curve)来校正最终结果。

2.3 样品前处理方法的确定

本文采用乙腈作为提取溶剂,主要是考虑到乙腈在有效提取目标物的同时具有沉淀蛋白的作用,且带出的弱极性成分较少。实验中比较了用15 mL乙腈分别提取不同次数的提取效果,实验结果表明提取两次的回收率达到85%以上。超声时间是对结果影响较大的因素之一,为此对不同超声时间进行了试验。分别选取了5 min,10 min和15 min三个时间点,在相同条件下对分析物进行测定,发现超声10 min后,样品的回收率就能达到90%以上。

2.4 基质效应

乳粉基质复杂,由于配方奶粉中含有较高脂肪,对雌二醇产生不同程度的基质抑制。提取净化前添加待测物的基质抑制效应比提取净化后添加待测物的基质抑制效应强,为了减少基质效应对雌性激素的抑制,通过液液萃取和SPE两个方法净化样品,均可减少基体成分的干扰。选取正己烷去油脂进行样品净化,效果较好。综合考虑各种影响因素,最终样品提取方法选定用15 mL乙腈提取两次,超声时间为10 min,液液萃取净化,以获得最佳的回收率。

2.4 线性范围和检出限

线性范围是指试样量与响应讯号之间保持线性关系的范围。将配制好的雌二醇标准贮备液用空白样品提取液稀释成质量浓度为5,10,25,50,100 ng/mL;按上述质谱条件分离测定,以质量浓度(P)和相应的定量离子峰面积比值(A)作线性回归,得到雌二醇回归方程为Y=0.00338X+0.00861,相关系数r=0.9986。在5~100 ng/mL范围内线性关系良好。以一空白奶粉作为试验样品,加入一定量雌二醇标准品,按上述检测方法测定,用质谱软件进行测定,以S/N=3/1为最低定性限(LOD),S/N=10/1为最低定量限(LOQ),样品的定量下限为1.0 g/kg。

2.5 回收率和精密度试验

取经检验不含雌二醇的样品,分别按样品中1、2、10 g/kg含量水平添加一定量的雌二醇标准溶液,每一添加浓度重复6份样品,按上述实验方法测定,计算其回收率和精密度。得到1~10 g/kg添加水平范围的回收率见表5。

表5 雌二醇回收率及精密度(n=6)

2.6 实际样品测试

使用本文建立的检测方法,对从超市中购买的30份婴幼儿配方奶粉进行了检测,结果均未检出含有雌二醇。

3 结论

实验结果表明,本文建立的HPLC-ESI-MS/MS方法具有特异性强、前处理简单、重复性好等特点,与传统的HPLC分离方法比较,分析时间大大缩短,灵敏度更高,定量下限为1.0 μg/kg。串联质谱MRM采集方式的高选择性使得方法的准确度更高,同时采用Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μ m)色谱柱使目标物和杂质得到较好的分离。该方法非常适合婴幼儿奶粉中雌二醇残留的快速检测。

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Determination of estradiol residues in dairy products by isotope internal stan⁃dard-liquid chromatography tandem mass spectrometry

YANG Jinqing,YU Chenghua,XUE Feng,QIN Yu,WANG Lei,LIU Yang
(Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research,Shanghai 200233,China)

A sensitive method for determination of estradiol in infant formula by liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/ MS)was established.The food sample was extracted by acetonitrile and concentrated and purified by n-hexane,then was separated and de⁃termined by HPLC-ESI-MS-MS.A linear calibration curve was obtained in the concentration range of 5~100 ng/mL.The linear correla⁃tion cofficients of the method are above 0.99.The detection limit of method(LOQ)is 1.0 μg/kg(S/N=10).The recoveries in three levels rang from 81.5%~112.4%.

HPLC;mass spectrometry;infant formula;estradiol

TS252.7

:A

:1001-2230(2017)03-0055-04

2016-04-05

国家自然科学基金项目(31301486);上海市自然科学基金项目(13ZR1439600)。

杨晋青(1983-),男,助理工程师,从事食品与化妆品分析测试。

刘洋

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