QuEChERS-UPLC-MS/MS监测护肤化妆品中13种性激素成分的非法添加

汪元符，刘志斌，熊震球，骆瑜，袁爱华，刘玢

（南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038）

QuEChERS-UPLC-MS/MS监测护肤化妆品中13种性激素成分的非法添加

汪元符，刘志斌，熊震球，骆瑜，袁爱华，刘玢

（南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038）

目的：针对护肤化妆品，建立13种性激素化学成分非法添加，采用QuEChERS前处理方式-超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的监测方法。方法：色谱柱为Phenomenex Luna Omega 1.6 μm C18100A，150 mm×2.1 mm，柱温为40℃，流动相为水及乙腈，梯度洗脱，流速为0.2 mL/min，以优化后的质谱参数采集信号。结果：各成分检出限浓度为2～30 ng/mL，定量限浓度为5～50 ng/mL，线性范围为各成分定量限～500 ng/mL，在线性范围内相关系数均在0.99以上，平均加样回收率在87.2%～99.8%。结论：本方法准确，灵敏度高，专属性好；可用于护肤化妆品中13种性激素化学成分非法添加的同时定性及定量监测。

QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱；护肤化妆品；性激素；非法添加

性激素包括雌性激素、孕激素、雄性激素三大类。性激素具有控制附性器官和第二性征的作用，同时参与人体内糖份、脂肪、蛋白质、无机盐等生命基本物质的代谢活动。当性激素直接作用于皮肤时，短期内可见促进毛发生长、防止皮肤老化、祛除皮肤皱纹、增加皮肤弹性等作用，长期应用则可能导致色素沉积、产生黑斑、皮肤萎缩变薄、甚至具有高度的致癌风险。因此，在护肤化妆品中非法添加性激素的行为具有高度风险。在最新颁布的《化妆品安全技术规范》（2015年版）中，列有雌三醇、雌酮、己烯雌酚、雌二醇、睾丸酮、甲基睾丸酮、黄体酮等7种性激素的检测和鉴定方法，采用的是液相色谱法及气相色谱-质谱联用法。液相色谱法存在不能确证的问题，气相色谱-质谱联用法存在衍生操作步骤繁琐，难以掌握与运用的问题。另一方面，我国实际生产并使用的性激素可达几十种之多，常见常用的也有十几种，只测7种存在监测方法严重缺失的问题。基于上述考虑，在进行护肤化妆品中性激素含量监测的实践中，本实验室引入快速、简单、价廉、高效、耐用、安全的QuEChERS前处理提取方法，结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测平台，采用电喷雾离子源负、正离子同时监测，能实现同时对13种常用的性激素定性确证与定量测定，能够更好地满足化妆品卫生安全监管中性激素监测的需要。

1 仪器、试剂与材料

AB Sciex 4000 Qtrap质谱， Ekspert ultraLC100超高效液相色谱仪，METTLER TOLEDO ME204E电子分析天平，METTLER TOLEDO XS105电子分析天平，Hettich Rotina 380R 1706 型医用低速离心机，昆山KQ-300DB 型数控超声波清洗器，Millipore超纯水系统。

试剂：乙腈（色谱纯，Merck），无水硫酸镁（优级纯），无水醋酸钠（优级纯），C18（粒度100 μm，安谱），PSA（安谱），石墨化碳（安谱）。

对照品：雌三醇（CAS No. 50-27-1，C13213200）、雌二醇（CAS No. 50-28-2，C13213000）、己烯雌酚（CAS No. 56-53-1，C12607000）、群勃龙（CAS No. 10161-33-8，C17607700）、雌酚酮（CAS No. 53-16-7，C13213230）、勃地龙（宝丹酮）（CAS No. 846-48-0，C10662000）、诺龙（19-去甲睾酮）（CAS No. 434-22-0，C15652000）、睾酮（CAS No. 58-22-0，C17322500）、甲 睾 酮（CAS No. 58-18-4，C15144000）、 黄 体 酮（CAS No. 57-83-0，C16342000）、丙酸诺龙（CAS No. 7207-92-3，C15652010）、丙酸睾酮（CAS No. 57-85-2，C17322540）、苯丙酸诺龙（CAS No. 62-90-8，100004-200603），除苯丙酸诺龙来源为中国食品药品检定研究院外其他均为Dr. Ehrenstorfer GmbH。

样品购自流通。溶液类样品共6批：护肤玫瑰精油（净含量：138 mL，保质期：20181101），双飞人爽水（净含量：50 mL，保质期：20201220），眼部精华液（净含量：20 mL，保质期：20180528），秀域佳芬保湿柔肤水（净含量：2 mL，保质期：20180305），北海道马油（净含量：25 mL，保质期：20181217），威治药庄逗可迪新生淡印精华（净含量：10 mL，保质期：20180706）。霜膏类样品共10批：冰王芦荟胶（净含量：30 g，保质期：20190301），青瓜沁水保湿洁面乳（净含量：100 g，保质期：20181023），达抒灵尿素维E护肤膏（净含量：50 g，保质期：20181019），修生润肤膏（净含量：10 g，保质期：20180602），裂王抗裂修复霜（净含量：80 g，保质期：20180609），二天堂灵芝芦荟祛痘膏（净含量：20 g，保质期：20190314），虎镖痘可迪清痘消痕乳膏（净含量：18 g，保质期：20190102），奇力康软质霜（净含量：10 g，保质期：20190721），亮芙美丽无痕修复霜（净含量：60 g，保质期：20180416），痤美先洁面乳（净含量：60 g，保质期：20180312）。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱分析条件

分析柱：Phenomenex Luna Omega 1.6 μm C18100A，150 mm×2.1 mm。柱温：40℃。流速：0.2 mL/min。进样量：5 μL。流动相：A为水，B为乙腈。按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI）：负离子模式（ESI－）及正离子模式（ESI＋）。扫描模式：多重反应监测（MRM）。扫描范围：50～600 Da。气帘气压力：25 Pa。碰撞气密度：中。电离喷雾电压：5500 V。离子源温度：500℃。雾化气压力：55 Pa。辅助气压力：50 Pa。界面加热状态：开启。离子对选择见表2。

表2 离子对质谱分析

2.3 对照品溶液的配制

取雌三醇、雌二醇、己烯雌酚、群勃龙、雌酚酮、勃地龙、诺龙、睾酮、甲睾酮、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙对照品各10 mg，精密称定，以乙腈制成每1 mL中各含10 μg的溶液作为对照品储备液。精密量取对照品储备溶液1 mL，以乙腈制成各含1000 ng/mL和100 ng/mL的溶液，作为对照品使用液。

标准系列工作液的配制：以10 mL量瓶制备，分别精密量取浓度为100 ng/mL 和1000 ng/mL的混合标准品使用溶液适量，以50%乙腈水溶液定容至10 mL，制成各含雌三醇、雌二醇、己烯雌酚、群勃龙、雌酚酮、勃地龙、诺龙、睾酮、甲睾酮、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙浓度为1.0 ng/mL，2.0 ng/mL，3.0 ng/mL，4.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10.0 ng/mL，20.0 ng/mL，30.0 ng/mL，40.0ng/mL，50.0 ng/mL，100.0 ng/mL，200.0 ng/mL，300.0 ng/mL，400.0 ng/mL，500.0 ng/mL的标准系列工作液。

2.4 供试品溶液的配制

取2 g试样（精确至0.01 g）置50 mL聚四氟乙烯具盖离心管中，加水至10 mL，振摇使分散均匀，再加入15 mL乙腈，涡旋振荡3 min，使充分分散均匀，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）30 min，放冷至室温，加入3 g无水硫酸镁和1.5 g无水醋酸钠，迅速振摇，涡旋振荡1 min，以5000 r/min离心5 min，取上清液作进一步净化。

净化：称取150 mg（±5 mg）PSA，300 mg（±5 mg）无水硫酸镁，100 mg（±5 mg）C18，50 mg（±5 mg）石墨化碳，置于15 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，移取5 mL上清液至此离心管中，涡旋混合1 min，以10000 r/min，离心3 min，移取上清液，经0.22 μm滤膜过滤，取滤液待测。

2.5 对照品浓度为100 ng/mL时各离子对提取质谱图，见图1～26。

图1 雌三醇定量离子对（287.1/171.0）提取质谱图

图2 雌三醇定性离子对（287.1/145.0）提取质谱图

图3 雌二醇定量离子对（271.0/145.0）提取质谱图

图4 雌二醇定性离子对（271.0/182.9）提取质谱图

图5 己烯雌酚定量离子对（267.1/251.1）提取质谱图

图6 己烯雌酚定性离子对（267.1/237.1）提取质谱图

图7 群勃龙定量离子对（271.1/253.1）提取质谱图

图8 群勃龙定性离子对（271.1/199.0）提取质谱图

图9 雌酚酮定量离子对（271.3/133.1）提取质谱图

图10 雌酚酮定性离子对（271.3/159.1）提取质谱图

图11 勃地龙定量离子对（287.3/121.3）提取质谱图

图12 勃地龙定性离子对（287.3/135.4）提取质谱图

图13 诺龙定量离子对（275.5/109.0）提取质谱图

图14 诺龙定性离子对（275.5/257.1）提取质谱图

图15 睾酮定量离子对（289.3/97.0）提取质谱图

图16 睾酮定性离子对（289.3/109.0）提取质谱图

图17 甲睾酮定量离子对（303.2/109.0）提取质谱图

图18 甲睾酮定性离子对（303.2/97.0）提取质谱图

图19 黄体酮定量离子对（315.2/109.0）提取质谱图

图20 黄体酮定性离子对（315.2/97.0）提取质谱图

图21 丙酸诺龙定量离子对（331.5/257.1）提取质谱图

图22 丙酸诺龙定性离子对（331.5/109.0）提取质谱图

图23 丙酸睾酮定量离子对（345.4/271.2）提取质谱图

图24 丙酸睾酮定性离子对（345.4/97.0）提取质谱图

图25 苯丙酸诺龙定量离子对（407.2/105.1）提取质谱图

图26 苯丙酸诺龙定性离子对（407.2/257.1）提取质谱图

2.6 定性确认

采用保留时间与对照品相一致，且定性与定量离子对相对离子丰度比应满足表3要求，判为检出。

各对照品试验结果见表4。

表3 定性确证时相对离子丰度比的最大允许偏差 （%）

2.7 线性关系及检出限、定量限考察

采用“2.1”项下的色谱条件，“2.2”项下的质谱条件，以“2.3”项下的标准系列溶液进样检测。以检测所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度（ng/mL）为横坐标，进行线性拟合。以定性离子对和定量离子对提取的质谱图信噪比均＞3时的浓度（ng/mL）为检出限。以定性离子对提取的质谱图信噪比＞3，定量离子对提取的质谱图信噪比＞10时的浓度（ng/mL）为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数＞0.99，为线性范围。结果见表5。

2.8 精密度试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为100 ng/mL的标准溶液，连续进样6针，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表6。

2.9 稳定性试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为100 ng/mL的标准溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分别进样，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表7。

表4 对照品试验结果

2.10 回收率试验

以基质较为复杂的冰王芦荟胶为空白样品进行加标。加标前以本法检测证实为阴性样品。平行取9份，分别为2 g，各精密加入对照品储备液（10 μg/mL）0.150 mL，0.375 mL，0.600 mL，然后按“2.4”项下其余步骤制备样液，以15 mL乙腈体积分数计，则最终加标样液浓度理论值应为100 ng/mL，250 ng/mL，400 ng/mL，以此计算回收率，结果见表8。

表5 线性关系及检出限、定量限考察结果

表6 精密度试验结果

表7 稳定性试验结果

表8 加标回收试验结果

各组分高、中、低3个浓度的回收率均在87.2%～99.8%。

2.11 样品测定结果

以本法检测了16个批次样品，结果仅一批眼部精华液检出雌酚酮，含量为0.72 mg/kg。

3 讨论

3.1 质谱条件的优化

曾分别试用化学电离（APCI）离子源与ESI离子源，结果表明APCI离子源离子化效率低，信号较弱，应采用ESI离子源。又经试验表明，雌三醇、雌二醇、己烯雌酚在负离子模式下信号更强，群勃龙、雌酚酮、勃地龙、诺龙、睾酮、甲睾酮、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙在正离子模式下信号更强。

3.2 液相色谱条件的选择

在已确定色谱柱的情况下，流动相及其洗脱方式的选择犹为重要。曾试用“0.1%甲酸水-乙腈”“乙酸铵溶液-乙腈”等酸性流动相系统，结果发现在酸性环境中对性激素的离子化会产生严重抑制，因而应使用中性的“水-乙腈”流动相系统，效果满意。流动相起始比例及洗脱方式也会影响信号的响应及不同组分能否分离。经试验，采用本法的洗脱方式，各组分信号较强，分离效果也佳。

3.3 QuEChERS方法的优化

本法采用了最基础的QuEChERS方法，结果尚满意。QuEChERS中所使用的吸附剂种类与配比还可进一步优化，能提高检测的准确性。

[1] 赵珊,吴大南,王鹏.高效液相色谱法同时测定化妆品中七种性激素[J].色谱,2004,22(3):267-269.

[2] 文毅,汪颖,周炳升,等.聚合物整体柱微萃取与高效液相色谱联用检测水性化妆品中的性激素[J].分析化学,2007,35(5):681-684.

[3] 王丽芳,李琼,姜佩华,等.高效液相色谱法同时测定化妆品中的5种性激素[J].精细化工,2008,25(5):479-481.

[4] 王丽芳,姜佩华,李琼.当前我国化妆品中性激素检测方法的进展[J].香料香精化妆品,2007,34(6):35-38.

[5] 刘华良,张菲菲,荣维广,等.超高效液相色谱法测定化妆品中性激素[J].江苏预防医学,2008,19(4):70-72.

[6] 王小芳,王菁,任韧,等.反相高效液相色谱法同时测定化妆品中的7种性激素[J].中国卫生检验杂志,2008,18(11):2199-2211.

[7] 刘华良,王联红,朱晓琳,等.化妆品中7种性激素的超高效液相色谱-串联质谱鉴定法[J].中国卫生检验杂志,2010,20(1):10-11,83.

[8] 袁金华,黄薇,查河霞,等.高效液相色谱法同时检测化妆品中7种性激素的条件选择及简化前处理[J].环境与职业医学,2010,27(8):509-511,514.

[9] 黄百芬,叶蕾,韩见龙,等.同位素稀释液相色谱-串联质谱法同时测定功能性化妆品中的25种性激素[J].中国卫生检验杂志,2011,21(5):1048-1053.

[10] 贾丽,刘希诺,王荣艳,等.超高效液相色谱串联质谱法测定化妆品中10种性激素残留[J].分析试验室,2011,30(6):57-60.

[11] 张龙贵,王建芬,魏丹丹,等.化妆品中违禁药物分析方法的研究概述[J].中国药师,2012,15(4):567-571.

[12] 许波,苌玲.液相色谱-四极杆-线性离子阱质谱仪联用法对护肤类化妆品中7种性激素的快速筛查[J].贵阳医学院学报,2013,38(5):479-481.

[13] 李显庆,王玲玲.化妆品中7种性激素高效液相色谱法同时测定[J].中国公共卫生,2014,30(3):359-360.

[14] 吴景,邢书霞,王钢力,等.化妆品中非法添加禁用物质检测技术研究进展[J].日用化学品科学,2015,38(10):5-9.

[15] 程俊,余佩佩,顾华,等.高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联法同时测定化妆品中8种性激素[J].分析试验室,2016,35(1):112-116.

[16] 国家食品药品监督管理总局.化妆品安全技术规范(2015年版)[S].2015年第268号.2015-12-23.

本文编辑：苏日力嘎

Monitoring on Thirteen Kinds of Sexual Hormones Illegally Added in Skin Care Cosmetics by QuEChERS-UPLC-MS/MS

Wang Yuan-fu, Liu Zhi-bin, Xiong Zhen-qiu, Luo Yu, Yuan Ai-hua, Liu Bin

(Nanchang Institute for Food and Drug Control, Jiangxi Nanchang 330038, China)

Objective：To establish a QuEChERS-UPLC-MS/MS method for determination of thirteen kinds of sexual hormones illegally added in skin care cosmetics. Methods：Phenomenex Luna Omega 1.6μm C18100A (150 mm × 2.1 mm) column was used at a temperature of 40℃, serving water-acetonitrile as a mobile phase at a flow rate of 0. 2 mL/min. The signal was collected under optimized condition. Results：The detection limit of this method was 2～30 ng/mL, while the limit of quantitation was 5～50 ng/mL. The linear range was the limit of quantitation～500 ng/mL, with R2values of more than 0.99. The test results showed the related coefficient in the linear range was more than 0.99. The average recoveries of the method were 87.2%～99.8%. Conclusion：This method is accurate, sensitive and specific, which can be used for the qualitative and quantitative determinations of thirteen kinds of sexual hormones illegally added in skin care cosmetics.

QuEChERS-UPLC-MS/MS; Skin care Cosmetics; Sexual Hormones; Illegally Added

O657.7＋2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.03.010

2016 - 12 - 25

护肤化妆品中性激素含量的监测，项目立项文号：洪科发计字【2016】96号，项目编号：第84项

汪元符，男，主管药师。研究方向：医药卫生。通讯作者E-mail：wanngel@126.com