DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应检测*

李朵璐，周玉冰，韩超，安琪，李峰，段震峰，张晓坚，阚全程

（郑州大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450052）

DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应检测*

李朵璐，周玉冰，韩超，安琪，李峰，段震峰，张晓坚，阚全程

（郑州大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450052）

目的 观察构建的DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应。方法构建DNA载体介导的小干扰RNA（siRNA）Tet-on表达载体，pDIRS4.1 siRNA。以增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因和白细胞介素6（IL-6）基因为目的基因，应用脂质体介导的瞬时转染方法，分别将pDIRS4.1/EGFP siRNA载体和pEGFP-N 3质粒、pDIRS4.1IL-6siRNA载体和p IRESIL-6质粒共转染人成骨肉瘤细胞，加入系列浓度的四环素（Dox）后，观察其诱导效应。结果pDIRS4.1 siRNA在人成骨肉瘤细胞中能够高效转染；随着Dox浓度升高，pDIRS4.1 siRNA载体在人成骨肉瘤细胞中对目的基因的沉默作用有较好的调控性，且目的基因的表达与Dox具有严格的剂量依赖关系，高浓度Dox时，IL-6表达水平降低约12倍。结论该研究构建的以DNA载体介导的能够高效调控siRNA沉默基因效应的Tet-On基因表达系统，能够促进其在更多模型系统中进行基因功能研究的应用。

小分子干扰RNA；四环素调控系统；DNA载体；基因调控

基因表达的调控作用对于解释不同生物的各种生物机制是至关重要的。利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术进行基因沉默，在研究肿瘤发生机制以及开发抗肿瘤靶向治疗药物方面是一个有效的研究手段[1-2]。目前，通过病毒载体介导的可调控性表达的RNA i载体系统，已经在哺乳动物的细胞模型和动物模型中，应用于基因功能的研究[3-5]。虽然病毒载体介导的RNA i调控系统有转染效率高的优点，但是病毒载体在制备过程中潜在的野生型病毒基因的污染所引起的使用安全性问题，及其高昂的制备费用，仍然是限制病毒型载体在临床广泛应用的重要原因[6-7]。因此，研发一种高效、低毒的基于非病毒载体的RNAi调控系统，对于促进这一技术在临床的广泛应用是必要的。

四环素调控系统能够在真核生物中，通过加入四环素（Tetracycline，Tc），或其类似物强力霉素（Doxycycline，Dox），实现对特定目的基因精准而高效的调控表达，这种类型的四环素调控系统，被称为Tet-On调控系统。在Tet-On调控系统中，在非诱导状态下，目的基因基本不表达，而当加入四环素时，可以实现目的基因强于背景基因105个数量级倍数的表达[8]。目前，四环素调控系统已经成功应用于包括植物、动物等多细胞生物在内的真核细胞生物[9-11]。

本研究首次将Tet-On调控元件与能够启动小干扰RNA（siRNA）表达的人U6启动子融合，构建了非病毒siRNA Tet-On基因表达载体pDIRS4.1。该载体系统目的siRNA的表达将随着外源性Dox的加入而增强，并将由于缺乏Dox而受抑制。本研究观察到pDIRS4.1在人成骨肉瘤细胞能够高效转染，并且能够有效调节siRNA对目的基因EGFP和IL-6的干扰效应。

1 材料与方法

1.1 载体系统构建

本研究构建的pDIRS4.1载体是在pTRE2hyg（美国BD公司）载体的基础上构建而成的。pTRE2 hyg载体是一种能够在Tet-On或Tet-Off基因修饰的细胞株中表达的质粒，是在Resnitzky等曾经报到的pUHD10-3载体的基础上发展而来[12]。首先，扩增pSilencerTM2.1-U6neo载体中（美国Ambion公司）RNA聚合酶Ⅲ依赖性的能够启动siRNA表达的人U6启动子序列（GenBank序列号：XO7425）。人U6启动子PCR扩增引物见表1。利用TA Cloning试剂盒（美国Invitrogen公司），将U6的PCR扩增产物克隆入pCR 2.1载体，鉴定。从pCR 2.1载体中酶切出U6启动子片段，与已经过SacI酶切（美国Promega公司）的pTRE2hyg载体连接。将重组质粒送上海生物工程股份有限公司进行测序鉴定。

表1 U6引物序列

构建表达EGFP或IL-6 siRNA的Tet-On表达载体，关键步骤是将目的基因的反向重复序列克隆至pDIRS4.1。选择编码EGFP siRNA和IL-6 siRNA的基因序列，通常以GG开头，并在每个基因编码区确定两个靶向结合位点，BLAST软件比对，确定选择的序列和其他基因不具有同源性。EGFP基因和IL-6基因的两个靶向结合位点序列见表2。合成以上带有靶向结合位点的EGFP siRNA和IL-6 siRNA寡核苷酸探针序列（美国Integrated DNA Technologies公司），退火，并将其反向连接入已经过BamHⅠ和CIaⅠ酶切酶切处理的pDIRS4.1载体，得到重组质粒。转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取。经BamHⅠ/CIaⅠ酶切鉴定，将重组质粒送上海生物工程股份有限公司进行测序鉴定。

1.2 细胞培养及转染

本研究应用的细胞株是课题组前期构建的稳定转染pTet-On的U-2OS Tet-On细胞株。U-2OS Tet-On细胞株用含有10%四环素调控系统专用胎牛血清的RPMI 1640培养液（美国Invitrogen公司，含100 u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素），在37℃二氧化碳培养箱中进行培养。转染前，将细胞接种至24孔板，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养至细胞融合达70%～80%时进行转染。采用脂质体（Lipofectamine PlusTM，美国Invitrogen公司）转染方法，按照2.5μl siRNA∶0.1μg质粒∶1μl转染试剂的比例，配制100nm的siRNA转染体系，将0.1μg/孔的pEGFP-N3质粒和0.5μg/孔的pDIRS4.1/ EGFPa siRNA或pDIRS4.1/EGFPb siRNA共转染至U-2OS Tet-On细胞。采用同样方法，将0.1μg/孔的 p IRESIL-6质粒和 0.5μg/孔的 pDIRS4.1IL-6a或pDIRS4.1IL-6b共转染至U-2OS Tet-On细胞。Dox应用蒸馏水配制为1 mg/ml的母液，过滤，并配制0.00、0.01、0.05、0.20和2.00μg/ml的Dox，避光置入-20℃冰箱冷冻保存。转染24 h后，分别加入配制的0.00、0.01、0.05、0.20和2.00μg/ml的Dox，并于转染48 h后观察结果。

表2 EGFP基因和IL-6基因的靶向结合位点序列

1.3 EGFP、IL-6表达的检测

EGFP的表达水平在转染后48 h，倒置荧光显微镜下观察。转染后96 h，收集细胞上清液，应用定量ELISA试剂盒（美国R&D公司）检测IL-6的表达水平，酶标仪450 nm处测定吸光值，并建立标准曲线，计算IL-6浓度值。

1.4 统计学方法

应用Graph Pad Prism 5统计软件进行数据分析，结果用均数±标准差（±s）表示，t检验比较不同组别间基因表达水平的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建的pDIRS4.1 siRNA载体系统

本研究在含有四环素反应元件（Tet-responsive element，TRE） 的 pTRE2hyg质粒基础上构建了pDIRS4.1 siRNA载体系统。在构建的pDIRS4.1载体的TRE-U6启动子区域下游存在一个多克隆位点（multiple cloning site，MCS）。构建的pDIRS4.1载体在系列Dox浓度下，实现对TRE-U6启动子下游目的siRNA的可调控性表达，pDIRS4.1载体的工作原理见图1。

本研究构建的 pDIRS4.1载体是通过将pTRE2hyg载体中的CMV启动子替换为能够启动siRNA表达的人U6启动子而构建成的。TRE在U6启动子上游，含有42 bp的7个同向重复的四环素操纵子序列（tet operator sequene，tetO）。因此，当加入外源性Dox时，U6启动子功能激活，从而启动下游siRNA的表达（见图1A）。

图1 pDIRS4.1 siRNA载体系统构建示意图

本研究构建的pDIRS4.1载体的结构图见图1B，它是建立在5.3 kb的含有潮霉素抗性基因的DNA载体pTRE2hyg的基础上。pDIRS4.1的U6启动子区域位于 320~577 bp。构建的 pDIRS4.1 EGFP siRNA载体，转录过程中能够形成含有10 bp环状结构的19~22 bp的发卡结构（见图1C）。

2.2 U-2OSTet-On细胞中pDIRS4.1 EGFP siRNA对EGFP表达的影响

随着加入不同浓度的Dox，能够有效诱导EGFP的表达，倒置荧光显微镜下可见，随着加入的Dox浓度增高，EGFP的表达量增加，证明U-2OS Tet-On细胞功能正常。在未加入Dox时，转染pTRE-d2EGFP质粒的细胞中几乎没有EGFP的表达（见图2A）。

在 U-2OS Tet-On细胞中，pDIRS4.1 EGFP siRNA对EGFP表达的干扰作用如图2B。在加入Dox 48 h后，EGFP的表达随着Dox浓度的增加而下降；而当未加入Dox时，EGFP的表达则几乎不受干扰。

2.3 U-2OS Tet-On细胞中pDIRS4.1IL-6siRNA对IL-6表达的沉默效应

图2 pDIRS4.1 EGFP siRNA对EGFP表达的调控作用 （倒置荧光显微镜×100）

表3 在U2OS Tet-On细胞中pDIRS4.1IL-6siRNA对IL-6表达的沉默效应 （n=3，pg/m l，±s）

表3 在U2OS Tet-On细胞中pDIRS4.1IL-6siRNA对IL-6表达的沉默效应 （n=3，pg/m l，±s）

组别IL-6 p IRESIL-6 630.53±16.77 p IRESIL-6+pDIRS4.1 EGFPsiRNA 622.50±13.02 p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：0.00μg/ml） 610.67±8.56 p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：0.01μg/ml） 504.56±23.61 p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：0.05μg/ml） 92.28±8.18 p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：0.20μg/ml） 61.52±6.30 PiresIL-6+pDIRS4.1IL-6a（Dox：2.00μg/ml） 50.68±9.52 p IRESIL-6p IRESIL-6+pDIRS4.1 EGFPsiRNA p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6b（Dox：0.00μg/m l）p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6b（Dox：0.01μg/m l）p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6b（Dox：0.05μg/ml）p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6ab（Dox：0.20μg/m l）p IRESIL-6+pDIRS4.1IL-6ab（Dox：2.00μg/m l）642.58±6.63 625.46±13.15 581.64±7.87 265.62±11.61 180.39±8.84 82.48±9.49 69.25±5.42

用p IRESIL-6质粒和构建的pDIRS4.1IL-6asiRNA或pDIRS4.1IL-6bsiRNA载体共转染U-2OS Tet-On细胞，转染后96 h，观察到了IL-6的表达与Dox浓度具有剂量依赖性关系，此外，将p IRESIL-6质粒和构建的pDIRS4.1 EGFP siRNA载体共转染U-2OS Tet-On细胞后，pDIRS4.1 EGFP siRNA并未影响IL-6的表达（见表3、4和图3）。

表4 不同组别Il-6表达的t检验比较

图3 U-2OS Tet-On细胞中pDIRS4.1 IL-6 siRNA对IL-6表达的沉默效应

3 讨论

自GOSSEN等首次报道四环素调控系统后，四环素调控系统至今仍是研究最详细、并广泛应用于哺乳动物细胞、转基因植物及转基因鼠的一种可调控性载体[14-15]。本研究首次将四环素调控元件和表达siRNA的质粒融合构建了以DNA载体介导的siRNA Tet-On载体系统，pDIRS4.1 siRNA。非病毒真核表达载体，以其安全低毒、更易获得的优点在转基因研究中广泛应用。限制非病毒DNA载体临床应用的主要原因是较低的转染效率以及不可控性的持续基因表达。然而本研究观察到pDIRS4.1 siRNA载体在U-2OS Tet-On细胞中能够高效转染，在共转染0.5μg pDIRS4.1/EGFP和0.1μg pEGFP-N3后，当没有加入Dox时，倒置荧光显微镜下观察到了pEGFP-N370%～80%的转染率，随着Dox浓度的增高，pDIRS4.1/EGFP几乎可以完全抑制pEGFP-N3中EGFP的表达，表明pDIRS4.1 siRNA载体在U-2OS Tet-On细胞中的高效转染。此外，本研究构建的pDIRS4.1 siRNA载体通过副作用较小、且价格相对低廉的Dox做诱导剂，能够实现对目的基因的可调控性表达，从而避免不可控的持续基因表达状态。

四环素调控系统质粒（pTet-On）在CMV启动子作用下表达四环素调控蛋白（rtTA）。当含有TRE的载体转染进入Tet-On细胞后，细胞内表达的rtTA与TRE结合，在Dox存在的情况下，启动下游基因的表达；在未加入Dox时，TRE介导的下游基因转录将会关闭。在有关pTet-On应用于组织培养的研究中表明，转染后4 h，能够检测到rtTA的表达，且在研究体系暴露于Dox的12～24 h后，能够观察到载体系统有效的诱导效应[8，12]。本研究应用了稳定转染pTet-On的U-2OSTet-On细胞，分别在转染后的48和96 h，观察pDIRS4.1/EGFP siRNA对EGFP表达的影响，以及pDIRS4.1IL-6siRNA对IL-6表达的影响，本研究结果观察到在低浓度Dox下，pDIRS4.1 siRNA载体中的TRE-U6启动子就能够有效抑制目的基因的表达。如结果图2和图3所示，在0～2μg/ml的Dox浓度范围内，EGFP和IL-6的表达被有效干扰，呈现较大幅度的降低，高浓度Dox时，IL-6表达水平降低约12倍。

本研究构建的pDIRS4.1 siRNA载体系统能够在哺乳动物细胞模型中，实现对目的siRNA的有效调控，并且目的siRNA的表达水平与Dox的浓度具有明显的剂量依赖性关系。pDIRS4.1 siRNA载体的应用，能够实现在界定时间内，逐步减少基因表达的基因功能研究，并且该工作原理的成功应用也同样适用于Tet-Off系统在基因功能研究中的运用。构建将有利于促进应用RNAi技术，在动物模型体内进一步开展有关肿瘤发生机制以及开发抗肿瘤靶向治疗药物方面的研究，从而能够对一些重要的参数进行更加准确地定量评估。

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（张西倩 编辑）

Detection of regulatory effects of a DNA vector-mediated Doxycycline-inducible siRNA system*

Duo-lu Li,Yu-bing Zhou,Chao Han,Qi An,Feng Li,Zhen-feng Duan, Xiao-jian Zhang,Quan-cheng Kan
(Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou,Henan 450052,China)

ObjectiveTo detect the regulatory effects of the established DNA vector-mediated Doxycyclineinducible siRNA system.MethodsA DNA vector-mediated Doxycycline-inducible siRNA system,pDIRS4.1,was established.The regulatory effects of pDIRS4.1 were investigated by detecting the expression changes of enhanced green fluorescent protein(EGFP)and interleukin 6(IL-6)after pDIRS4.1/EGFP siRNA,pEGFP-N3 plasmid, pDIRS4.1/IL-6 siRNA and pIRES IL-6 plasmid had been cotransfected into U-2OSTet-On cells respectively which were added with serial concentrations of Doxycycline(Dox).ResultsThe results showed that a high transfection efficiency(70%～80%)was obtained in the U-2OS Tet-On cells with pDIRS4.1 siRNA.pDIRS4.1 siRNA showed tight gene regulatory effects in the U-2OS Tet-On cells with the increase of Dox concentrations.Furthermore,the expressions of EGFP and IL-6 mediated by pDIRS4.1/EGFP siRNA and pDIRS4.1/IL-6 siRNA respectively had dose-dependent effectwith the concentration of Dox.When the concentration of Dox was high,the expression level of IL-6 decreased 12 times.ConclusionsA Dox-inducible siRNA expression system has been established through a non-viral mammalian expression vector.Tightly-regulated inducible siRNA expression systems of this type willlikely have wide application in exploring gene functions in numerousmodel systems.

small interference RNA;Tet-On system;DNA vector;gene regulation

R733

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.007

1005-8982（2017）07-0030-06

2016-04-12

河南省优秀创新型科技团队医学科技攻关计划项目（No：201303013）

阚全程，E-mail：quanchengkan@126.com