重症手足口病患儿血清S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群的相关性研究

韦祎+梁薇+黄月艳+唐汉庆+李晓华+李清锋+谢毅强+谢跃琦+温晓梅

【摘要】目的观察重症手足口病（HFMD）患儿血清星形胶质源性蛋白（S100B）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平与T淋巴细胞亚群的变化及相关性，并讨论其临床价值。方法选取2015年1～9月收治的HFMD患儿156例，包括普通病例80例（普通组），重症病例76例（重症组），另外选取70例健康幼儿作为对照组。采用流式细胞技术检测外周血T淋巴细胞亚群，采用ELISA法检测血清S100B和NSE水平，并分析血清S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群的相关性。结果与对照组比较，普通组和重症组T淋巴细胞总数、CD4+、CD8+、CD4+ /CD8+均降低，且重症组降低更加明显（P<0.01）。与对照组和普通组比较，重症组血清S100B水平（1.64±0.28）μg/L和NSE水平（5283±4.68）ng/ml均升高（P<0.01）。重症组血清S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群呈负相关（P<0.01）。结论T淋巴细胞亚群和血清S100B、NSE水平指标组合对于重症手足口病的早期识别具有一定的参考价值。

【关键词】手足口病；T淋巴细胞亚群；星形胶质源性蛋白；神经元特异性烯醇化酶

中图分类号：R512.5文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.005

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation of the serum levels of S100B，NSE and Tlymphocyte subsets in children with severe handfootmouth disease （HFMD） and discuss their clinical value.MethodsA total of 156 children with HFMD admitted to hospital from January to September，2015 were collected and divided into general group （80 cases） and severe group （76 cases），70 healthy children were selected as control group.Changes of peripheral blood Tlymphocyte subsets were examined by flow cytometry and the serum levels of S100B and NSE were detected by ELISA.In addition，the correlation of the serum levels of S100B，NSE and Tlymphocyte subsets was discussed.ResultsCompared with the control group，total amount of T lymphocyte，CD4+，CD8+ and CD4+/CD8+ of both the general group and the severe group all decreased，and those of the severe group decreased more significantly（P<0.01）.Compared with the control group and the general group，both the serum level of S100B（1.64±0.28）μg/L and the serum level of NSE（52.83±4.68）ng/ml in the severe group all increased（P<0.01）.The levels of serum S100B and NSE were negatively correlated with T lymphocyte subsets in the severe group（P<0.01）.ConclusionCombination of Tlymphocyte subsets and the serum levels of S100B and NSE can provide definite reference value in the early identification of severe HFMD.

【Key words】HFMD；Tlymphocyte subsets；S100B； NSE

手足口病（handfootmouth disease，HFMD）是兒科常见传染病，临床表现轻重不同，具有传播较快、传染性较强的特点。轻型以手、足、口腔、臀部出现斑丘疹、疱疹体征为主，而重症型多累及神经系统，出现脑炎、无菌性脑脊髓膜炎等脑损伤病变。重症型患儿病情进展快，由于对重症型辨别主要靠临床症状，当出现脑损伤表现时，病情往往已很严重，临床治疗难度增大，病死率高。因此，早期辨识重症型值得探讨。HFMD由肠道病毒感染所致，常见的病毒如肠道病毒71型（EV71）及柯萨奇病毒A16型（CoxA16）。研究表明病毒感染后，T淋巴细胞激活引起的免疫应答在HFMD发病机制中起着重要作用[1，2]，而血清星形胶质源性蛋白（S100B）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平是反映脑损伤程度的灵敏指标[3]。本研究通过检测重症HFMD患儿外周血T淋巴细胞亚群和血清S100B、NSE水平变化并探讨其相关性，为重症HFMD的早期识别提供组合参考指标。

1对象与方法1.1研究对象选取2015年1月至9月在儿科收治住院诊断为HFMD的患儿156例为研究对象。普通病例组（普通组）80例，男48例，女32例；年龄8个月～8岁，平均（2.45±0.72）岁。重症病例组（重症组）76例，男40例，女36例；年龄9个月～10岁，平均（3.11±1.02）岁。另外选取经过健康体检中心体检的健康幼儿70例作为对照组，其中男40例，女30例，年龄10个月～9岁，平均（3.26±1.15）岁。本研究获得医院伦理委员会和患儿监护人书面知情同意。

1.2入选及排除标准依据卫生部手足口病临床专家组研究制定的《手足口病诊疗指南（2010年版）》诊断标准以及《肠道病毒71型感染重症病例临床救治专家共识（2011）》[4]。普通病例：急性起病，发热，口腔黏膜出现散在疱疹，手、足、臀部出现斑丘疹、疱疹，疱疹周围出现炎性红晕，疱内液体较少，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等症状，部分病例仅表现为皮疹或疱疹性咽峡炎。重症病例：神经系统受累表现为精神差、嗜睡、头痛、易惊、谵妄、昏迷；肢体抖动、肌阵挛、共济失调、眼球震颤；无力或急性迟缓性麻痹；惊厥；查体可见脑膜刺激征；腱反射减弱或消失。呼吸系统受累表现为呼吸浅促、呼吸困难或节律改变，紫绀、血性泡沫样痰、肺部湿啰音或痰鸣音。循环系统受累表现为面色苍白或灰白、四肢发凉、指（趾）发绀、脉搏浅速等。排除标准：（1）有脑发育不良、结核感染者；（2）近1个月有呼吸道等感染病史；（3）颅脑外伤性损伤，遗传性免疫性疾病，合并严重心、肝、肾等系统疾病。

1.3血清S100B和NSE水平检测无菌非抗凝管空腹采集各组新鲜外周血2 ml，4℃ 1000 r/min离心10 min，吸取血清，每管50 μL分装于EP管中，置-70℃冰箱保存待检。采用双抗体夹心ELISA法测定血清S100B、NSE水平，在酶标仪450 nm波长测各孔的OD值，与标准曲线比较并计算相应样品的浓度。操作严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒由北京生物科技有限公司提供。

1.4T淋巴细胞亚群检测各组空腹抽取静脉血2 ml，置于EDTA抗凝管。管中依次加入 CD4+Ftc、CD8+pe、CD3+Percp三色抗体各10 μL，室温避光孵育25 min，每管加入200 μL溶血素，轻轻吹打，在室温下避光静置 15 min，裂解红细胞；观察溶液澄清透明后，加入預冷 PBS 液1 ml，室温下3000 r/min离心10 min，去上清，加入1 ml PBS液摇匀，滴加1%多聚甲醛液100 μL固定，上流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群。所有抗体由北京生物科技有限公司提供。

1.5统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用LSDt检验，相关性分析采用Pearson检验，检验水准：α=0.05。

2结果2.1各组血清S100B和NSE水平比较与对照组比较，重症组血清S100B和NSE水平均升高，差异有统计学意义（均P<0.01）；与普通组比较，重症组血清S100B和NSE水平均升高，差异有统计学意义（均P<0.01）。见表1。

2.2各组T淋巴细胞亚群检测结果比较与对照组比较，普通组和重症组T淋巴细胞总数、CD4+百分比、CD8+百分比、CD4+/CD8+比值均降低，差异均有统计学意义（均P<0.01），以重症组降低明显。见表2。

2.3血清S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群相关性Pearson相关分析结果表明，重症组血清S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群呈负相关（均P<0.01）。见表3。

3讨论HFMD主要致病原是肠道病毒EV71以及CoxA16，是儿科急性传染病，分为普通型和重型、危重型。重型和危重型属于重症HFMD，进展快，病死率高。早期对重症HFMD实施干预措施，能防止其恶性进展，众多临床实践已经表明干预越早，效果越好。对于重症HFMD的早期诊断，相关血清学指标或敏感参照物的选择尚未达成共识，有研究[5]通过动态监测D二聚体水平可为危重型HFMD的危险度分层、病情严重程度的预测及预后评估提供血清学指标的参考。另外有研究[6]观察危重型HFMD在有神经系统受累症状体征基础上，通过分析基础生命体征包括体温、心率、呼吸频率、血压的变化，以期对危重型HFMD的早期识别提供有价值的参考。鉴于目前对重症HFMD的临床诊断主要依靠症状体征、颅脑影像学检查，存在一定的滞后性，因此，如何早期辨识重症HFMD值得探讨。本研究通过检测HFMD血清S100B和NSE水平及T淋巴细胞亚群的变化并观察其相关性，从血清学指标和免疫功能变化角度为早期识别重症HFMD提供思路，以供同仁讨论。

T淋巴细胞在免疫应答中起着重要作用，根据表型的不同分为CD4+细胞和CD8+细胞亚群，其中的CD4+细胞作为免疫辅助性细胞，功能上主要与促进体液免疫和细胞免疫相联系，而CD8+是细胞毒性细胞或抑制性细胞，功能上是抑制免疫应答[7]，生理情况下，CD4+细胞数量、CD8+细胞数量维持稳定以及CD4+/CD8+比值保持在一个平衡状态，使机体免疫功能处于与内外环境相适应状态。因此，通过检测T淋巴细胞亚群可以了解机体的免疫功能，对于免疫性疾病的发生发展和预后具有重要的临床参考价值[8]。

肠道病毒EV71以及CoxA16感染人体后，人体抗病毒感染的免疫应答启动，T淋巴细胞亚群变化可以反映机体免疫功能，在本实验工作中，我们注意到普通组和重症组T淋巴细胞总数、CD4+百分比、CD8+百分比、CD4+/CD8+比值均降低，而以重症组降低明显，提示T淋巴细胞亚群变化有作为较早识别重症HFMD的潜在性。

S100B主要存在于中枢神经系统的星状胶质细胞，NSE主要存在于神经元和神经内分泌细胞中，重症HFMD主要表现为中枢神经系统受累，意味着脑组织在不同程度上受损，由于病毒感染、免疫应答伤害或继之引起的炎症损害等都可能损伤脑神经元和血脑屏障，导致S100B和NSE进入血液或脑脊液，引起其水平升高[9，10]，这一改变先于重症HFMD临床表现和相关影像学检查出现，是反映脑损伤程度的灵敏指标。

T淋巴细胞亚群在机体的免疫方面发挥着重要的免疫调节和免疫作用，对病毒的清除以及疾病的转归有重要影响。若T淋巴细胞总数或相关亚群数量下降则提示其功能低下，对病毒清除能力减弱，则病毒感染对脑神经元造成的损害越大，表现为血液中S100B和NSE水平持续升高，因此，S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群在病毒感染损伤与抗病毒感染能力之间产生了联系，这样就为综合S100B、NSE水平与T淋巴细胞亚群以推知HFMD的病情或预后提供了途径。

在本实验中，普通组血清S100B和NSE水平虽比对照组有升高，但差异不大，而重症组与普通组、对照组比较，重症组血清S100B和NSE水平升高，差异明显，提示病毒感染早期，重症HFMD在血清S100B和NSE水平上即可表现出与普通组和对照组的显著差别，而且，血清S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群的相关性显示，重症组血清S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群呈负相关，表明重症HFMD免疫功能低下，抗病毒感染能力严重下降，与之对应的是脑损伤程度已很严重。因此，综合考虑，血清S100B和NSE水平与T淋巴细胞亚群变化组合对于重症HFMD的早期辨识有可能成为一条有效的思路。参考文献[1]Wang YF，Zheng R，Chen BG.Casecontrol study on immuneparameters and clinical significance of handfootmouth disease[J].Zhejiang Prev Med，2010，22（10）：1521.

[2]Zhou T，Ma LZ，Fu SM.Correlation analvsis of handfootmouth in patients with humoral immunity and its outcomes[J].Guangdong Med J，2010，31（18）：24342435.

[3]Wiesmann M，Missler U，Gottmann D，et al.Plasma S100B protein concentration in healthy adults is ageand sexindependent[J].Clin Chem，1998，44（5）：10561058.

[4]中華人民共和国卫生部.肠道病毒71型（EV71）感染重症病例临床救治专家共识（2011年） [DB/OL].[2011-05-13].http：//www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohyzs/s3585/201105/51750.htm.

[5]张水路，宋春法. 危重型手足口病患儿血浆D二聚体动态变化及预后评估价值[J]. 中国当代儿科杂志，2013，15（12）：11191122.

[6]杜兴媛，李英，邓坤，等. 基础生命体征对危重型手足口病的早期诊断价值[J].中国当代儿科杂志，2015，17（6）：602606.

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[8]邓长柏，陈燕，程钦，等.手足口病患儿外周血细胞因子及T淋巴细胞检测结果分析[J].中国妇幼卫生杂志，2013，4（34）：15，18.

[9]胡静，石小华，田野，等.重症手足口病患儿血清及脑脊液中神经元特异性烯醇化酶水平测定及意义[J].实用医学杂志，2012，28（20）：33903391.

[10]黄舒，陈彤，赵枰.手足口病合并病毒性脑炎患儿血清S100B 蛋白测定及意义[J].放射免疫学杂志，2012，25（6）：714715.

（收稿日期：2016-07-25修回日期：2016-10-25）