人胎盘底蜕膜间充质干细胞纹状体移植治疗帕金森病模型大鼠的实验研究

肖振勇+卢国辉+覃军+闫宪磊+陈家康+李学东

【摘要】目的研究人胎盘底蜕膜间充质干细胞（hPDBMSCs）纹状体移植对帕金森病（PD）模型大鼠行为学的影响。方法体外传代培养hPDBMSCs，使用6OHDA制备大鼠PD模型并随机分为移植组、假手术组、模型组，对移植组大鼠右侧纹状体进行hPDBMSCs移植，术后1 W、2 W、4 W进行行为学检测。免疫组化检测移植后1 W、2 W及4W各组大鼠损伤侧黑质酪氨酸羟化酶（TH）的表达。结果hPDBMSCs移植后2 W、4 W，移植组大鼠阿朴吗啡诱导的平均旋转圈数明显低于假手术组及模型组（P<0.01）；免疫组化显示移植组损伤侧黑质部位移植后4 W TH阳性细胞数较移植前明显增加（P<0.01）；与假手术组相比，移植术后1 W、2 W、4 W移植组TH阳性细胞明显增多（P<001）。结论hPDBMSCs移植能够抑制PD模型大鼠多巴胺能神经元丧失，改善PD模型大鼠的行为学症状，具有一定的治疗作用。

【关键词】间充质干细胞；底蜕膜；神经保护；帕金森病

中图分类号：R742.5；R457.7文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.001

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of human placental decidua basalisderived mesenchymal stem cells（hPDBMSCs） striatum transplantation in the treatment of Parkinsons disease（PD） on rat models.MethodshPDBMSCs were cultured in vitro.PD rat models were prepared by 6OHDA and divided into transplantation group，sham operation group and model group.HPDBMSCs transplantation was performed on the right striatum of the transplantation group，and behavioral detection was carried out 1W，2W and 4W after operation.Immunohistochemical method was used to detect expression of tyrosine hydroxylase （TH） in wounded sides among all the groups 1W，2W and 4W after transplantation.Results2W and 4W after transplantation，mean rotational circle induced by apomorphine（APO） in the transplantation group were lower than those in the sham operation group and the model group（P<0.01）.Immunohistochemistry showed that TH positive cell numbers of the substantia nigra in the wounded sides 4W after transplantation significantly increased compared with those before transplantation in the transplantation group（P<0.01）.Compared with the sham operation group，TH positive cell numbers 1W，2W and 4W after transplantation in the transplantation increased more significantly（P<0.01）.ConclusionhPDBMSCs transplantation can inhibit the loss of dopaminergic neuron，improve behavioral symptoms of PD model rats，it has certain treatment effects.

【Key words】mesenchymal stem cells；decidua basalis；neuroprotection；PD

帕金森病（Parkinsons Disease，PD）是一种较为常见的中老年人神经系统退行性疾病。目前临床上尚无有效方法延缓疾病的进展。随着干细胞技术的发展，研究人员开始探索通过细胞移植来延缓或抑制中脑黑质部多巴胺能神经元的凋亡，从而恢复神经环路中多巴胺递质的水平治疗PD。目前已有研究表明骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）移植能够改善帕金森病模型大鼠的行为学症状。人胎盘底蜕膜间充质干细胞（human placental decidua basalisderived mesenchymal stem cells，hPDBMSCs）具有和骨髓间充质干细胞相似的形态学、免疫表型和功能特点[1]。因而，本实验拟通过对PD大鼠纹状体进行hPDBMSCs移植，探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞移植对PD模型大鼠的行为学的影响。

1資料与方法1.1材料

1.1.1实验动物实验中所用大鼠均为SPF级SD大鼠，雌雄各半，共100只，体重180～220 g，8～12周龄，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK桂2003-0005）。

1.1.2实验主要试剂及器材DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，美国）；6羟基多巴（6hydroxydopamine，6OHDA）、阿朴吗啡（apomorphine，APO）、小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH；Sigma公司，美国）；SP三步法免疫组化试剂盒及SP两步法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥公司）；脑立体定向仪（Stoelting公司，美国），细胞培养箱（SHEL LAB公司，美国），Eppendorf 5810R低温高速离心机（Eppendorf公司，德国），ULWCD0.30倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），光学显微镜及成像系统（Leica公司，德国）。

1.2实验方法

1.2.1hPDBMSCs的复苏与培养实验中所用细胞为hPDBMSCs细胞系，为南昌大学第一附属医院神经外科卢国辉博士所馈赠，相关细胞分离培养过程及鉴定结果见文献[1]。复苏过程中需将冻存的hPDBMSCs细胞从液氮罐中取出，快速移入37℃温水中进行解冻，完全解冻后移入离心管中加入10倍体积的DMEM/F12培养基，置入离心机中离心5 min，转速为1000 rpm。去除上清液后用含10%FBS的DMEM/F12培养基重悬，按1×106/L密度接种于25T培养瓶中。37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，次日进行换液，待细胞融合达到80%左右用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2传代，定期在显微镜下观察细胞形态。传代3次后留取对数生长期细胞备用。

1.2.2帕金森病大鼠模型的制作参照大鼠脑立体定向图谱[2]，使用6OHDA建立PD大鼠模型，右侧中脑黑质致密部（SNc）靶点坐标：前囟后4.8 mm，中线偏右1.7 mm，硬膜下7.5 mm。右侧中脑腹侧被盖（VTA）靶点坐标：前囟后4.6 mm，中线偏右0.9 mm，硬膜下7.3 mm。分别向各靶点位置缓慢注入6OHDA 4 μg（用0.2%抗坏血酸生理盐水配制成2 μL）。注药速度为1 μL/min，留针5 min后缓慢退针。术后一周开始观察大鼠行为学变化，并进行APO诱导旋转实验，腹腔注药10 min后人工计数30 min内大鼠恒定向左旋转圈数，一周一次，连续3周，若恒定向左旋转圈数>210 r/30min，则视为成功制作PD大鼠模型。

1.2.3动物分组及细胞移植将54只PD大鼠模型按照随机数字表分成三组：移植组、假手术组、模型组，每组18只。再根据观察时间点不同分为1 W、2 W、4 W三个亚组，每个亚组6只。将体外传代培养3次处于对数生长期的hPDBMSCs进行消化离心，用PBS缓冲液重悬将细胞数调整为1×105个/μL备用。分别向移植组和假手术组大鼠右侧纹状体部位微量注入5 μL hPDBMSCs和5 μL PBS缓冲液。右侧纹状体坐标为前囟前1.0 mm，正中线左侧3.0 mm，硬膜下5.0 mm。模型组不作任何处理。

1.2.4行为学评估移植后1 W、2 W、4 W观察各组大鼠的行为学变化，并对其行APO旋转诱导实验，计数用药后30 min内的旋转圈数，求取平均旋转圈数（rpm/min）。

1.2.5免疫组织化学染色检测TH的表达各个亚组的大鼠经行为学评估后进行免疫组化实验，用4%多聚甲醛灌注固定，切取前囟后4.4 mm至7 mm层面脑组织，2天后行石蜡包埋。石蜡切片经过脱蜡、脱水后，用柠檬酸缓冲液热抗原修复15 min，室温冷卻后用PBS缓冲液冲洗3 min。按照SP免疫组化试剂盒说明书行TH免疫组织化学染色。步骤如下：室温下3%过氧化氢孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次；正常羊血清工作液封闭，37℃ 10 min，勿洗；每张切片滴加50 μL小鼠抗大鼠TH一抗，阴性对照组滴加等体积PBS，置入4°冰箱中孵育过夜，PBS冲洗3 min×3次；每张切片滴加50 μL生物素化二抗（羊抗小鼠IgG），室温下孵育15 min后用PBS冲洗3 min×3次；滴加50 μL辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，室温孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次；DAB显色，显微镜下控制反应时间，及时用蒸馏水终止反应；切片复染、脱水透明后用中性树脂封片，显微镜下观察结果并拍照。选取5张切片，在高倍镜（×400）同一背景下选取5个不同视野进行细胞计数，分别计数损伤侧与健侧TH阳性细胞数，并计算出损伤侧与健侧阳性细胞百分比进行统计分析。

1.3统计学方法本实验所有计量资料均以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 13.0统计软件进行分析，应用ONEWAY方差分析及t检验，检验水准：α=0.05。

2结果2.1PDBMSCs体外培养的形态学特征在倒置显微镜下见复苏后细胞于4 h左右（图A）出现贴壁生长，也有部分细胞仍然处于漂浮状态，此时贴壁细胞的特点是呈巨单核细胞，形态不一，可有梭形、多角形或星芒状突起为单个或多个。24 h后换液，可见所有贴壁细胞多以梭形或者多角形细胞状态，细胞生长至瓶壁的50%左右（图B）。一般传代48 h即可长至瓶壁80%水平，细胞表现出旋涡状，细胞形态大小基本均匀一致。A：4 h后细胞形态；B：24 h后细胞形态。

2.2行为学评估结果实验中，75只SD大鼠成功造模54只，成功率为72%。主要表现为竖毛、躬身、少动、行动迟缓、尾僵、头偏斜、嗅探等。移植术前各组平均旋转圈数差异无统计学意义（P>0.05）。hPDBMSCs移植术后各时间点APO诱导平均旋转圈数，移植组均低于假手术组及模型组。术后2 W及4 W，移植组APO诱导的平均旋转圈数较假手术组及模型组明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。假手术组和模型组的旋转行为手术前后比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1各组不同观察时间点的平均旋转圈数比较（n=18，rpm/min，±s）

分组1移植前1移植后1 W12 W14 W移植组111.1±1.8110.3±1.718.8±1.6ab15.8±1.4ab假手术组110.8±1.5111.2±1.4110.9±1.7111.1±2.0模型组111.3±1.7111.2±1.5110.8±2.0110.9±1.6F10.4112.0518.02157.19P10.66710.13910.00091<0.001注：与移植前相比，aP<0.01；与假手术组相比，bP<0.01。

2.3TH免疫组化染色结果通过TH免疫组化实验我们发现（见表2、图2）：模型组与假手术组手术前后脑黑质部位损伤侧与健侧阳性细胞百分比差异无统计学意义（P>0.05）。移植组中，术后2 W及4 W损伤侧阳性细胞数与健侧阳性数相比明显增加，差异均有统计学意义（P<0.01）。

表2各组大鼠黑质不同观察点TH表达（n=6，%，±s）

分组1移植前1移植后1 W12 W14 W移植组122.1±1.7128.6±1.8ab132.5±2.0ab143.2±1.9ab假手术组121.5±1.4121.6±1.3121.8±1.5120.9±1.4模型组121.7±1.6122.1±1.2121.7±1.6120.8±1.5F10.23143.09178.711383.27P10.8001<0.0011<0.0011<0.001注：与移植前相比，aP<0.01；与假手术组相比，bP<0.01。

A：假手术组1 W时TH表达；B：假手术组2 W时TH表达；C：假手术组4 W时TH表达；D：移植组1 W时TH表达；E：移植组2W时TH表达；F：移植组4 W时TH表达。

3讨论据统计，帕金森病在60岁以上人群中，其发病率超过1%，是中老年人常见的致残疾患之一[3]。现有研究认为，PD的主要病变部位在中脑黑质部以及纹状体区域，主要病理改变是中脑黑质致密部多巴胺能神经元选择性凋亡，使黑质纹状体通路DA释放减少，从而导致基底节神经调节功能的紊乱[4]。若能将合成和分泌多巴胺的细胞移植入黑质纹状体系统，替代已死亡的多巴胺细胞，从理论上讲是最为理想的治疗措施。正因如此，干细胞移植治疗帕金森病被广泛研究。间充质干细胞被认为是一种理想的种子细胞，主要获取来源为骨髓、脂肪、羊膜、脐带等。骨髓是间充质干细胞的最初来源，然而研究发现，骨髓中间充质干细胞含量低，且在衰老或疾病状态下，骨髓间充质干细胞数量及增殖分化能力将进一步下降[5]。此外，目前虽然多数研究表明骨髓间充质干细胞治疗能够延缓PD模型大鼠中脑黑质部位多巴胺能神经元凋亡，从而改善其症状[6]。然而，也有学者发现同种异体骨髓MSC移植后移植灶周围可见明显的免疫反应，并不能阻碍中脑黑质多巴胺能神经元的减少和改善模型鼠的行为学症状[7]。但与BMMSCs相比，hPDBMSCs来源更为丰富，获取方便，培养条件低，体外扩增能力强。研究发现，hPDBMSCs能够表达胚胎干细胞的一些标记物，如SSEA4、TRA160以及TRA181[8]。经传代培养数十次后hPDBMSCs仍维持原有的细胞表型，并具有较强的增殖分化能力[1]，此外，有研究表明，胎盘来源的MSC具有免疫调节作用，且这种效应与MSC的细胞数量呈正相关，无同源性限制[9]。这些结果表明，hPDBMSCs可能是一种更为原始的MSCs，有可能是一种较为理想的移植细胞来源。在本实验中，我们发现，hPDBMSCs作为一种新的间充质干细胞来源，同样能够改善PD大鼠的症状，减少多巴胺能神经元的凋亡。

移植途径是干细胞移植治疗中值得关注的问题，移植后的效果以及移植成功与否在一定程度上取決于移植途径的正确选择。对于帕金森病而言，细胞移植存在多种移植途径，包括黑质移植、纹状体移植、脑室内移植、静脉移植等。至于何种移植方法更为有效，尚无明确定论。但有学者通过研究发现，在BMMSCs中，纹状体移植效果优于脑室内移植及静脉移植[10]，PD模型大鼠行为学症状改善更为明显。在既往研究中，我们发现，hPDBMSCs静脉移植后PD模型大鼠的行为学症状可以得到改善[11]。但通过对比分析，我们发现采用纹状体移植后，大鼠行为学症状改善更为明显。这些结果提示，纹状体移植可能是一种更为有效的移植方式，这与既往一些学者的研究结果相符[10，12]。此外，我们还发现，细胞移植2周后，大鼠黑质部位TH阳性细胞数量增多。这些数据表明在PD大鼠模型中，hPDBMSCs能够通过某些机制分化为多巴胺能神经元替代受损的多巴胺能神经元，或者抑制多巴胺能神经元的凋亡。

综上所述， hPDBMSCs作为一种新的间充质干细胞来源，通过纹状体移植能够更为有效地延缓多巴胺能神经元的凋亡或者替代受损多巴胺能神经元，改善PD模型大鼠的症状。但其具体机制仍有待进一步研究。参考文献[1]Lu GH，Wang SY，Xu ZM，et al.Human placental decidua basalis-derived mesenchymal stem cells differentiate into dopamine neuron-like cells with no response to longterm culture in vitro[J].Neuroreport，2012，23（8）：513518.

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（收稿日期：2016-08-16修回日期：2016-10-23）

（编辑：潘明志）