MSCs与CD34+单核细胞共培养联合脱细胞支架植入体内构建兔阴茎海绵体

李瑞庭 刘志瀚 冀晨阳 肖小莲 梁伟强 张金明

MSCs与CD34+单核细胞共培养联合脱细胞支架植入体内构建兔阴茎海绵体

李瑞庭 刘志瀚 冀晨阳 肖小莲 梁伟强 张金明*

目的研究将异体骨髓间充质干细胞（MSCs）和CD34+单核细胞（MNCs）共培养体系种植于脱细胞海绵体支架上在兔体内构建阴茎海绵体组织的可行性。方法分别从兔骨髓与兔外周血中提取并鉴定MSCs与CD34+MNCs，将两种细胞组分以107/mL的密度种植于制备好的兔阴茎海绵体脱细胞胶原支架上，同时将相同密度的MSCs、CD34+MNCs分别种植于支架上，培养4天后植入一种兔阴茎海绵体缺损模型中。3个月后对工程化组织进行取材，行H&E及Masson三色染色等组织学检测。结果MSCs和CD34+MNCs共培养组近白膜处的海绵体保留了正常海绵体结构，而MSCs组、CD34+单核细胞组及空白支架组以疤痕增生为主，尽管较之CD34+单核细胞组及空白支架组，间充质干细胞组疤痕组织中的血管数目较多（P＜0.05）。结论我们的研究证明了将MSCs和CD34+MNCs的共培养体系种植于脱细胞支架上植入兔体内可以构建出一段组织学上与原生海绵体相似的组织；CD34+MNCs在体内主要通过协同MSCs而非单独发挥其促血管化的生物学效应。

CD34+单核细胞；骨髓间充质干细胞；脱细胞海绵体支架；组织工程；组织工程化阴茎海绵体；阴茎再造

0 背景

阴茎损伤，阴茎肿瘤以及一些先天性的生殖区畸形比如说严重的尿道下裂，膀胱外翻⁃尿道上裂综合症和性别分化障碍常常需要阴茎重建［1⁃3］。目前阴茎重建的效果局限于形态上大体令人接受，而无任何勃起功能。阴茎重建的常规方法包括各种皮瓣转移［4⁃7］，这不仅导致受区的损伤，重构的阴茎还无任何勃起功能。为了克服上述缺点，阴茎组织工程技术应运而生。阴茎组织工程旨在重构一个无论在形态上还是在功能上都与原生的阴茎高度相似的器官，正是基于这样一个诱人的前景，过去十余年间人们对阴茎组织工程进行了大量研究［8⁃14］。值得一提的是，Chen等人宣称他们团队成功地利用自体海绵体平滑肌细胞和内皮细胞联合海绵体脱细胞支架构建出了一整段有功能的兔阴茎［11］。尽管在阴茎海绵体组织工程领域取得的巨大进展，将动物成果转化为人组织工程器官仍障碍重重，因为在临床案例中很少有供利用的正常海绵体平滑肌及内皮细胞。鉴于成体干细胞强大的分化特性以及旺盛的生殖特性，我们曾利用从肌肉中取得的间充质干细胞（肌源性干细胞）构建低容量的阴茎组织［12，13］。我们发现种植有肌源性干细胞的脱细胞支架在体内发生了不同程度的纤维化和散在的组织坏死。

最近，我们注意到两种细胞组分的组合，血管内皮前体细胞（EPCs）和间充质干细胞（MSCs），可以大大提高新生血管的数量和质量［15］。内皮前体细胞主要分布于骨髓，成人外周血和人类脐带血中，可以分化为成熟的内皮细胞，不仅在胚胎发育时期参与血管生成和血管化，还在组织损伤修复的血管化中起重要作用［16］。有研究指出它们可以促进心梗［17，18］及脑梗灶［19］的血管化。此外，在骨组织工程中，两种细胞组分的联合植入不仅可以促进骨组织的血管化，还可以促进骨细胞的生成［20，21］。

因此，在本研究中，我们利用了CD34+单核细胞（MNCs）——一种包含了EPCs的细胞亚群——与MSCs共培养，来检验它们在阴茎组织工程中分化与再生的潜能。

1 材料和方法

1.1 脱细胞海绵体支架（ACCM）的制备

本研究中包含的所有动物实验方案由中山大学动物伦理委员会审批通过。根据之前文献中描述的方案［12］，ACCM取材于死兔子的阴茎海绵体。简单地讲，首先将阴茎去除皮肤，尿道和肉膜，留下两根相连的阴茎海绵体及环绕周围的白膜，并将其横切成4 mm长；然后将阴茎海绵体组织放入装有清水的烧杯中，在4度环境中用磁力搅拌器搅拌24 h，使得部分细胞裂解，随后再用2%的Triton X⁃100（Sigma⁃Aldrich）和0.1%的氨水搅拌处理10天，1 mol/L的脱氧核酸酶（Sigma⁃Aldrich）处理12 h，最后再用磷酸缓冲盐水处理24 h。脱细胞支架经干燥处理后用环氧乙烷消毒，备用。从制备完成的脱细胞支架中随机抽样经H&E染色和Masson三色染色确认无细胞特性。

1.2 骨髓间充质干细胞（BM⁃MSCs）的分离和扩增

BM⁃MSCs取自5只雄性新西兰兔的骨髓抽取物。简略地说，用18G针头和EDTA⁃K2处理过的注射器于兔一侧髂骨穿刺抽取骨髓，抽取物用PBS以1∶2的比例稀释，并将其置于Ficoll梯度溶液（Sigma⁃Aldrich）之上，用400 g的速度离心25 mins。离心后，单核细胞成分被吸出并被洗涤，用红细胞裂解液去除其中的红细胞成分，再将其种入装有商品化兔间充质干细胞培养基（赛业）的T⁃25细胞培养瓶中，于敷箱中敷育5天。5天后，非贴壁的细胞被除去，被认为是间充质干细胞的贴壁细胞在相同条件下继续敷育15天，隔天换一次培养基，直到瓶中细胞的汇合度达到80%～90%。用细胞免疫荧光染色技术检测细胞样本中的CD34抗原（Miltenyi Biotec），CD105抗原（Gene⁃Tex）以及α⁃SMA抗原（Sigma⁃Aldrich），确认是否为MSCs。

1.3 外周血CD34+单核细胞（CD34+MNCs）的分离

与上述方法相似，CD34+单核细胞的提取也是通过密度梯度分离法完成的。不同的是，血抽自颈静脉，以1∶1的比例用PBS稀释，每50 mL离心管中装20 mL稀释液。洗涤之后，单核细胞组分被标记上结合有FITC的抗CD34抗体（Sigma⁃Al⁃drich），之后再结合抗FITC的磁珠（Miltenyi Bio⁃tec）。根据供货厂商的指南完成磁珠分选。阳性标本和阴性标本进一步行流式检测来确定每个样本的阳性率。

1.4 两种细胞组分的种植和共培养

以下所有的操作步骤都应保证无菌。24只干燥且无菌的ACCM被放入96孔板中，每个孔放一只，随后在有标本的孔中加入培养基（每孔约200 μL）。标本截面需与孔底垂直以保证两截面都与培养基有相同的接触机会，保证ACCM完全浸入培养基。在剩余的空白孔中加入PBS，96孔板放入4℃冰箱后静置过夜。

在种植之前，将细胞培养板置于37℃敷箱中敷育20分钟。第三或第四代的BM⁃MSCs被消化，离心和洗涤。获取的细胞在培养基中重悬，加入或不加入相等数量的CD34+MNCs，样本经细胞计数仪计数保证其终浓度达到每毫升107个细胞。共培养，BM⁃MSCs，以及CD34+MNCs的细胞悬液以每类6孔，每孔200 μL的量加入共计18孔的96孔细胞培养板中，剩余6孔中加入不含细胞的培养基作为空白支架组。支架在各样的培养基中37℃敷育24 h。最后，经各样细胞悬液/培养基浸泡过的ACCM被转移至24孔板中培养4天，每天更换培养基。用组织免疫荧光染色技术检测支架样本中的CD34抗原，CD105抗原以及α⁃SMA抗原。

1.5 移植

在包皮内板上距包皮内外板交界处约5 mm处环切，暴露肉膜，肉膜下阴茎背侧部各有两条血管。仔细分离并保留上述血管及尿道后截断阴茎海绵体。4 mm长的支架插入阴茎海绵体两残端，用6⁃0聚乙醇酸缝线间断缝合两吻合端，并在两吻合端用6⁃0聚丙烯缝线各缝一针作标记。根据处理的不同，24只新西兰白兔被随机平均分为4组：共培养组种植有MSCs与CD34+MNCs共培养体系的ACCM，MSCs组植入种植有MSCs的ACCM，CD34+MNCs组植入种植有CD34+MNCs的ACCM，空白支架组植入浸泡有培养基的ACCM。术后3天所以实验动物均使用抗生素及镇痛药物。

1.6 组织学检测

植入后三个月，余下23只兔子，1只兔子死于细菌感染。将这23只兔子麻倒后取材，于距吻合端约5 mm的正常组织处截断阴茎海绵体，于每个移植物正中横向截断再生海绵体。用4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，再用石蜡切片机横切切成10 μm厚的切片行苏木素⁃伊红（H&E）染色及Masson三色染色。用光学显微镜行组织学检测。

1.7 统计学分析

统计分析采用SPSS 20.0软件进行，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在显微镜下贴壁的细胞呈锥形或梭形，用细胞荧光测定术检测后这些细胞被确认为MSCs。抗CD34染色基本阴性，而抗CD105及抗α⁃SMA染色为阳性结果。对经磁珠分选的样本行流式回测，此样本在经磁珠分选时已标记有抗CD34和FITC偶联的信号。阳性分选标本的阳性率为95.8%，而阴性分选标本的阳性率仅为8.01%。脱细胞支架与Ji等人［12］描述的非常相似。简而言之，支架的结构与阴茎海绵体脱细胞前大致相似，但经处理的支架颜色苍白，质地柔软。（图1）在组织学层面上，肉眼可辨别的血窦结构更少，胶原纤维的排布更松散。在切片中未发现细胞核结构。Masson三色染色显示空白支架中均为胶原纤维，无平滑肌细胞。（图2）

图1 兔阴茎海绵体脱细胞支架大体观：

图2 脱细胞支架的组织学检测

3个月后将所有动物处死取材。在共培养组的大体标本中，可看见新生海绵体色泽红润，触之稍软；而空白支架组的标本则较为苍白，触之硬韧。（图3）在HE染色中，仅有共培养组近白膜处保留了正常海绵体的组织学结构，其中包含了上千个血窦结构（黑色箭头标出），在血窦结构之间穿插有排列不规则的脉管结构（蓝色箭头标出）。Masson三色染色显示，血窦结构被进一步分成了多个平滑肌成分单位（红染），后者可以被包裹及突入其中的胶原纤维（蓝染）区别。相反在其他组别中，海绵体正常结构被破坏，取而代之的是无再生平滑肌肌束的疤痕组织。有意思的是，在MSCs组别中，尽管也充满着纤维化的疤痕组织，但血管化程度明显高于CD34+MNCs组和空白支架组。（图4）

图3 植入3月后的组织工程化海绵体大体观

图4 ⁃1植入3月后的组织工程化海绵体组织学检测

图4 ⁃2植入3月后的组织工程化海绵体组织学检测

3 讨论

据我们所知，之前并没有人描述过兔正常阴茎海绵体血管的解剖。与人类的阴茎海绵体血管走行不同，兔阴茎背侧近段及中段正中大体上无血管走行，无所谓阴茎背深静脉。阴茎动静脉与阴茎体平行走行于阴茎背侧方，大约在10点和2点钟的方向。静脉在动脉侧外方，夹着尿道。在远端，血管逐渐向背侧及浅面发出分支。考虑到兔阴茎血管特殊的走行，我们选择阴茎中段为手术入路，并以环切方式保证分离尿道和血管的准确性。

在我们的实验中，尽管CD34+MNCs中富含血管前体细胞，但是作为海绵体组织工程的种子细胞，CD34+MNCs单独使用的血管化效果并不理想。CD34+MNCs组不仅没有再生出海绵体组织，在疤痕中的血管化效果甚至不及MSCs组。这说明在体内，CD34+MNCs是通过协同MSCs而非单独发挥其促血管化的生物学效应。有文献指出，相比内皮细胞，MSCs被认为可以分泌更多的VEGF，且在体外共培养系统里VEGF的表达有所上调［22］。此外，在体外实验中，EPCs参与维持MSCs的干性［23］。最后，MSCs的组织整合可以通过内皮细胞集落形成细胞源性生长因子激活血小板衍生物生长因子BB/血小板衍生物生长因子受体β信号通路而上调，这提示了CD34+MNCs对于促进MSCs的组织整合和防止MSCs的细胞凋亡中起到了独特作用［24］。

我们的结果不仅证明了MSCs与CD34+MNCs共培养体系强大的成血管能力，还验证了它们在体内向平滑肌谱系分化的能力。有报道指出注射进体内的MSCs有分化成SMCs的能力，还有促进血管重塑的能力［25，26］。然而在我们的实验中，种植在支架上的MSCs在体内并没有分化为平滑肌，而是纤维化形成了疤痕。越来越多的证据提示在体外，从血管壁上分离的间充质干细胞有分化为功能血管全部细胞成分（包括内皮细胞和血管平滑肌细胞）的能力［27］。当与EPCs共培养时，骨髓MSCs可能被赋予血管壁来源MSCs的细胞学特性，最终分化为平滑肌组分。值得一提的是，正常人类阴茎海绵体内血窦中的内皮细胞周围并无周细胞［28］，这使得在工程化组织过程中无需发挥MSCs的成纤维间质作用。

相比于肌源性干细胞，同种异源性骨髓间充质干细胞更易获取和扩增。除了技术上的便捷，MSCs受到了大量研究，并成功应用于临床，在治疗诸如移植物抗宿主病中发挥了巨大的作用［29］，因此，当应用于人阴茎海绵体重建时，骨髓干细胞具有成熟的商业来源。CD34+单核细胞可以从人的外周血中获得。在临床应用中，获取途径的便利性可以为两者联合植入带来一个光明的前景。

尽管MSCs与CD34+MNCs共培养组靠近白膜的工程化组织具有正常的海绵体结构，但其深部组织仍以纤维化为主，我们并没有就工程化组织的深度作出定量分析。我们也没有对植入的阴茎海绵体在不同的时间点行组织学或免疫荧光检查，失去了动态观察阴茎海绵体组织分化及血管化的机会。最后，我们也没有行任何实验追溯再生平滑肌的细胞来源。

4 结论

我们的研究验证了将MSCs与CD34+MNCs共培养体系种植于脱细胞支架植入体内可以构建出一部分与原生海绵体类似的阴茎海绵体组织，CD34+MNCs在体内主要通过协同MSCs而非单独发挥其促血管化的生物学效应。

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Construction of rabbit tissue⁃engineered corpus cavernosum with co⁃culture of BM⁃MSCs and CD34+MNCs and transplantation in vivo

LI Ruiting，LIU Zhihan，JI Chenyang，XIAO Xiaolian，

ObjectiveTo investigate the feasibility of co⁃cultured mesenchymal stem cells（MSCs）and CD34+mononuclear cells seeded in acellular matrix to construct a section of rabbit tissue⁃engineered cavernosum in vivo.MethodsMSCs and CD34+mononuclear cells（MNCs）were extracted from bone marrow and peripheral blood.After being identified，the two components of the cells were seeded in prepared acellular corporal matrix alongside with MSCs and CD34+MNCs seeded in the same density respectively.The cell⁃laden matrix was transplanted into a rabbit model of penile interruption after culture for 4 days in vitro.Three months after implantation，animals were killed and the engineered tissue was collected for histological examination（H&E staining and Masson′s trichrome staining）.ResultsThe engineered corporal tissue near tunica albuginea in MSCs and CD34+MNCs cocultured group preserved the histological feather of intact corporal tissue.The other 3 groups，including MSCs group，CD34+MNCs group and acellular matrix group，failed to preserve the corporal structure.Instead，they underwent fibrosis and formed scar tissue though samples from MSCs group showed more small vessels than from CD34+MNCs group and acellular matrix group（P＜0.05）.ConclusionOur work demonstrates the feasibility of co⁃implantation of MSCs and CD34+MNCs in acellular matrix to construct corporal tissueresembling to native one.CD34+MNCs promote vascularization in vivo along with MSCs rather than alone.

CD34+Mononuclear Cells；bone marrow⁃derived Mesenchymal stem cells；acellular corporal matrix；tissue engineering；tissue⁃engineered corpus cavernosum；penile reconstruction

R622

A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.02.011LIANG Weiqiang，ZHANG Jinming.Department of Plastic Surgery，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou，510120，China.Corresponding author：ZHANG Jinming，zxmrwk@126. com

2017-03-05）

广东省自然科学基金（2015A030313028）

510120广州中山大学孙逸仙纪念医院整形外科

*通讯作者：张金明，E⁃mail：zxmrwk@126.com