缺氧条件下骨髓间充质干细胞对人冠状动脉内皮细胞自噬和凋亡的影响

马 迅 李鸿木# 王略力 陶 俊 林喜锋 华 平 熊利华*

缺氧条件下骨髓间充质干细胞对人冠状动脉内皮细胞自噬和凋亡的影响

马 迅1李鸿木1#王略力2陶 俊1林喜锋1华 平1熊利华1*

目的探索缺氧状况下MSC对内皮细胞自噬的诱导以及对早期凋亡率的影响。方法构建HCAEC与MSC间接共培养模型，实验分组：共培养组：MSC与HCAEC共培养；单独培养组：HCAEC单独培养；对照组：HCAEC使用与共培养组相同的培养基进行单独培养。上述各组分别予常氧（5%CO2，95%空气）和缺氧（1%O2，5%CO2，94%N2）培养24 h，Western blotting检测各组HCAEC细胞LC3蛋白和Beclin⁃1蛋白的表达量，RT⁃qPCR检测各组HCAEC细胞LC3基因和Beclin⁃1基因的表达水平，流式细胞术检测各组HCAEC细胞早期凋亡率。结果共培养组与单独培养组相比、以及缺氧组与常氧组相比，LC3蛋白和Beclin⁃1蛋白表达量均有升高（P＜0.05）。各组间LC3基因和Beclin⁃1基因的表达水平没有检测到明显差异（P＞0.05）。缺氧组中共培养组的早期凋亡率为（8.86%±1.48%），明显低于单独培养组（15.23%±2.56%）和对照组（14.49%±3.31%）（P＜0.05）。结论MSC可以诱导HCAEC产生自噬，并在缺氧状况下改善HCAEC的生存状况，减少早期凋亡率。

缺氧；冠状动脉内皮细胞；骨髓间充质干细胞；共培养；自噬；凋亡

0 前言

骨髓间充质干细胞（bone marrow⁃derived mes⁃enchymal stem cells，BMMSCs）是一群来源于骨髓组织、具有多项分化能力的非造血多能干细胞。此类细胞在经过分离培养和扩增后仍保留分化的潜能。近年来关于MSC生物治疗效应的研究十分火热，基于MSC低免疫原性、多分化性、体外易培养扩增及独特的归巢功能等多方面的特点，多项研究发现在应用于多种疾病的治疗［1-4］、促进机体自我修复等有良好前景和巨大的潜力。有报道称MSC对于心血管系统亦有类似的治疗作用［5］，机制包括自噬、凋亡、免疫、抑制迁移与侵袭能力等多个方面。

自噬（autophagy）是细胞在一般条件和应激条件，特别是营养缺乏的条件下通过降解和更新细胞组件维持细胞生存的分解代谢过程。自噬也是某些恶性肿瘤细胞的生存机制之一。自噬一般分为三种，分别为巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaper⁃one⁃mediated autophagy）、其中巨自噬是细胞自噬的主要表现形式。Ashford等在1962年的一次肝灌流实验中首次观察到自噬现象［6］。在自噬过程中，自噬体膜形成的初期通过ATG4（autophagy⁃related gene4）蛋白切割在胞浆中形成微管相关蛋白轻链3（LC3⁃I），后者在自噬体膜上与Atg3与Atg7活性位点形成硫酯键，进一步与磷脂结合形成LC3⁃PE，即自噬体膜上的LC3⁃Ⅱ［7］。LC3⁃Ⅱ与自噬体的形成有着紧密的联系，有人发现去除LC3⁃Ⅱ会造成自噬体结构的异常，影响自噬的发生［8］。因此LC3⁃II被普遍认为是自噬体的标记物。自噬相关蛋白6（ATG 6，或Beclin⁃1）是核心的自噬调节蛋白，该蛋白的上调总体反映了自噬活动度的上升。

缺血缺氧是许多严重心血管疾病中常见的病理现象，亦存在于外科手术，特别是心脏外科体外循环手术中。持续的缺氧可以造成血管内皮细胞死亡，血管活性下降。Xu等［9］在研究中发现缺氧可以诱导人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）间充质化（endothelial⁃mesenchymal transition，EndMT），后者则被发现与心脏纤维化有着明显关系［10］。近年来利用MSC进行血管性疾病的生物治疗的研究得到了广泛的重视，而MSC改善缺氧性心血管疾病的机制尚未完全清楚。本实验观察了MSC对缺氧性血管内皮细胞自噬以及凋亡的影响，并检测了自噬相关基因的表达量，和相关蛋白表达量的变化，初步探索缺氧状况下MSC对心血管内皮细胞自噬的诱导以及对早期凋亡率的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂来源

胎牛血清（Fetal Bovine Serum，Gibco，美国，澳洲血源），低糖DMEM（Hyclone），内皮细胞培养基EGM⁃2（endothelial growth medium，LONZA），人LC3A/B，Beclin⁃1单克隆抗体（Cell Signaling Tech⁃nology，美国），鼠抗人CD34，CD105，CD29，HLA⁃DR流式抗体（BD Pharmingen），Annexin V FITC/PI凋亡试剂盒（eBioscience），Promega GoScript反转录试剂盒，Promega SYBR Green荧光定量PCR试剂盒，引物由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.2 人冠状动脉内皮细胞的培养

HCAECs（Human Coronary Artery Endothelial Cells）购自美国cell application公司的冻存细胞株（由广州医科大学附属第二医院刘世明教授赠送），细胞接种于EGM⁃2培养基中，培养基中添加了氢化可的松（Hydrocortisone）0.04 mg/mL，人表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）0.1 mg/mL，R3胰岛素样生长因子⁃1（R3⁃Insulin⁃like Growth Factor⁃1，R3⁃IGF⁃1），抗坏血酸（Ascor⁃bic Acid）0.1 mg/mL，人成纤维细胞生长因子β（uman Fibroblast Growth Factor⁃Beta，hFGF⁃β）0.4 mg/mL，肝素（Heparin）0.1 mg/mL，青霉素-G（Peni⁃cillin⁃G，PG）100 U/mL，链霉素（streptomycin）100 U/mL。胎牛血清浓度为10%。细胞于复苏后24 h内贴壁生长，镜下观察细胞大致呈椭圆形，胞质透明，核深染，细胞间形态基本一致，各个细胞方向不一致，呈鹅卵石状排列（图1），当细胞生长达80%～90%密度时，用0.25%胰酶（0.25%trypsin⁃EDTA solution，GIBCO，USA）消化（1～2 m）后1∶2传代，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。传代后2～3天更换一次培养基，当细胞再次生长至80%～90%密度后重复以上步骤。取3～5代细胞用于实验。

1.3 人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

hBMMSC来自中山大学孙逸仙纪念医院生物治疗中心，从健康的志愿者（18～28岁）体内依照标准步骤提取［11］。流式细胞术鉴定CD34，HLA⁃DR，CD105和CD29表面抗原的表达以鉴定MSCs。BMMSC接种于低糖DMEM培养基中，培养基中添加了人成纤维细胞生长因子β（Human Fibroblast Growth factor⁃Beta，hFGF⁃β）0.05 mg/mL。胎牛血清浓度为10%。当细胞生长状况良好，铺满瓶底（细胞融合90%左右）时，用0.25%胰酶（0.25% trypsin⁃EDTA solution，GIBCO，USA）消化（2～3 m）后1：2传代，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。传代后2～3天更换一次培养基，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养孔的底面，再重复以上操作。取3～5代细胞用于实验。

1.4 HCAEC/MSC共培养体系的建立

使用Corning costar cell culture transwell inserts（膜孔径0.4 μm，膜面积4.67 cm2，小室外径24 mm2）建立HCAECs和MSCs共培养体系，6孔板及tran⁃swell小室接种前置于37℃培养箱中1 h以上。HCAEC先接种至下层6孔板内，加EGM⁃2完全培养基2.6 mL。过夜，镜下观察细胞贴壁后，置入transwell小室，将BMMSC接种于上层小室内，加入L⁃DMEM完全培养基1.5 mL。两种细胞无法通过孔径0.4 μm的transwell insert膜，但是两室培养液可通过该膜交通。

1.5 实验条件与分组

正常培养实验在37℃，95%空气，5%CO2的普通培养箱内进行。缺氧培养实验在37℃，1%O2，5%CO2，94%N2的缺氧培养箱内进行。

根据缺氧/常氧、单独/共培养将实验条件分为6组：

常氧单独培养组：HCAEC+EGM

常氧共培养组：HCAEC/BMMSC共培养+EGM/ LG⁃DEME

常氧对照组：HCAEC+EGM/LG⁃DEME

缺氧单独培养组：HCAEC+EGM（hypoxia）

缺氧共培养组：HCAEC/BMMSC共培养+EGM/ LG⁃DMEM（hypoxia）

缺氧对照组：HCAEC+EGM/LG⁃DEME（hypoxia）

1.6 RT⁃qPCR检测LC3和Beclin⁃1的表达

上述各组细胞经过不同处理以后，提取细胞的总RNA，使用荧光分光光度计Nano drop 3300测定浓度，A260/A280控制在1.9～2.1之间。取8 μg总RNA，按照Promega GoScript（Promega，美国）反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。PCR反应条件如下：预变性70℃5 min，退火25℃5 min，延伸42℃60 min，失活MLV 70℃15 min。得到的cDNA产物于-20℃保存。使用Promega公司的RT⁃PCR试剂盒，应用SYBR Green染料法，取2 μL反转录扩增产物进行RT⁃PCR检测。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，45个循环。熔解曲线：95℃5 s，65℃1 min，97℃30 s。数据运用Excel，应用2-ΔΔCt方法相对定量mRNA的表达量，各组目的基因经过与内参基因比较后，再分别与常氧单独培养组基因表达量比较。

图1 HCAECs复苏后第二天（40×）

表1 引物序列

1.7 western blot检测各组LC3和Beclin⁃1蛋白的表达情况

上述各组细胞经过对应处理后，弃去培养基经预冷PBS洗涤后加入胰酶（trypsin，0.25%）消化后转移至1.5 mL离心管中离心，弃上清后PBS洗涤，再次离心，弃上清，按照1×106细胞加入100 μL裂解液，冰上裂解40 min，离心后取上清为细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，调整各组上样量为15 μg，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件：75 V 20 min，100 V 50 min。转膜条件：0.1 A 250 W，300 V，90 min。转膜后，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，兔抗人LC3A/B抗体（1∶1000）、BECLIN⁃1抗体（1∶1000）（Cell Signaling Technology，美国），4℃孵育过夜；HRP标记羊抗兔IgG抗体（1∶3000）（Cell Signaling Technology，美国）孵育1 h。PBST洗膜后，用Fluor ChemQ成像系统显示相应蛋白条带，照相。利用ImageJ图像分析软件分析蛋白条带灰度值后SPSS 20.0进行统计学分析。

1.8 流式细胞术检测各组细胞早期凋亡情况

细胞经过上述各组处理后，利用流式细胞术检测各组细胞早期凋亡情况。检测当日消化细胞，收集于离心管中1000 r/min离心5 min，弃上清，加入4℃预冷PBS 2 mL重悬细胞，转移至流式专用玻璃管内离心1000 r/min 5 min，弃上清。加入试剂盒专用Binding buffer（BD Biosciences）400 μL重悬细胞，将细胞分成两管，其中一管不加任何试剂作为空白对照。加入Annexin V FITC（eBioscience，美国）5 μL，避光室温孵育15 min，加入PI（Propidium lodide，碘化丙锭，eBIoscience）10 μL，流式细胞仪检测分析（BD FACSVerse流式检测仪，BD Biosciences，美国）。

1.9 统计学方法

各实验均重复3次，采用SPSS 20.0软件处理，数据以mean±SD表示，先进行方差齐性检验，之后根据数据类型采用ANOVA分析或独立样本的t检验，P＜0.05为各组间存在统计学异质性。

2 结果

2.1 细胞培养与鉴定

细胞传代后24 h内贴壁，镜下观察胞体较大，呈长梭形，胞核色深（图2），后贴壁细胞逐渐增多，3～4 d形成集落，彼此相连，表现出方向一致性，呈旋涡状、辐射状、网状排列。流式细胞术检测细胞CD34，HLA⁃DR为阴性，而CD105和CD29为阳性（表达率分别为81.69%和99.96%），可以表明该细胞为MSCs（图3）。

图2 传代后第一天的MSC（40×）

2.2 Western blot检测各组细胞LC3蛋白和Beclin⁃1蛋白的表达量

我们利用Western blot检测了经过各组处理后细胞的LC3蛋白（图4）与Beclin⁃1蛋白（图5）含量，结果显示，共培养组与单独培养组相比、以及缺氧组与常氧组相比，两种蛋白表达量均有升高（P＜0.05），这两种处理均诱导了HCAEC自噬的发生。

图3 流式细胞术鉴定结果

图4 各组LC3蛋白表达量比较（LC3⁃II/内参蛋白）

图5 各组Beclin⁃1蛋白表达量

2.3 RT⁃qPCR检测各组HCAEC细胞LC3基因和Beclin⁃1基因的表达水平

利用RT⁃qPCR检测各组细胞LC3、Beclin⁃1基因mRNA表达情况（图6、7），结果提示共培养组LC3、Beclin⁃1基因mRNA表达量与正常培养组对比未见明显变化，这表明MSC并未在mRNA水平上影响HCAEC的自噬基因表达。

2.4 流式细胞术检测各组细胞早期凋亡情况

对比可发现缺氧组（D、E、F）与常氧组（A、B、C）相比早期凋亡率明显上升，缺氧组中共培养组（F）的早期凋亡率为（8.86%±1.48%），明显低于单独培养组（D）（15.23%±2.56%）和对照组（E）（14.49%±3.31%）（P＜0.05），而D和E之间无明显差异（P＞0.05）。

图6 各组Beclin⁃1基因表达情况

图7 各组LC3基因表达情况

图8 各组细胞早期凋亡情况

3 讨论

心血管疾病（如冠心病）可以造成不同程度的组织、器官的缺氧，特别是需要进行心脏外科体外循环手术的病人从发病、手术、到术后整个过程中都会经历冠脉血管缺氧的过程，已有文献表明血管内皮细胞缺氧会导致血管内皮细胞活性下降，内皮功能障碍，从而影响冠脉供血心肌的营养供应，加上冠心病需冠脉搭桥的病人通常心肌对于缺血缺氧等应激情况的抗打击能力相当薄弱，越来越多的人开始关注缺氧导致的内皮损伤以及带来的一系列后果。

有研究表明BMMSC存在较高的免疫抑制能力［12］。BMMSC在被移植到心脏表面时可能以旁分泌的形式释放或诱导释放抗炎、组织修复、血管生成等相关的因子，包括TIMP1、IGF1、VCAM1、SDF1A、HIF1A和MMP2［13］。因此，心功能的改善可能与MSC的免疫抑制及抗炎作用有关。但是，MSC对于心血管系统的保护作用并不只有免疫调节功能。

本次结果显示，缺氧培养和BMMSC与HCAEC共培养可以使HCAEC的LC3蛋白和Beclin⁃1蛋白表达量上调，二者共同作用的结果则是使两种蛋白的表达量进一步上调。在正常对照组与缺氧单独培养组的对比中，我们可以发现缺氧诱导自噬的同时HCAECs的早期凋亡率上升，而在共培养组与单独培养组，特别是缺氧条件下的共培养组与单独培养组的对比中，自噬的上调的同时HCAECs的早期凋亡率明显下降，这可能表明BMMSC诱导的自噬与缺氧诱导的自噬对于改善HCAECs缺氧微环境的效应有所不同。但同时亦有文献表明，抑制Beclin⁃1的表达可以避免过度的自噬对于心肌细胞的损害［14］，因此我们猜测这可能是由于BMMSC对于不同种细胞的影响的差异，亦或是BMMSC在不同的应激情况和水平下具有不同的效应。Beclin⁃1蛋白可能受到多种因素的调控，包括miRNA，磷酸化/去磷酸化，苏素化/去苏素化，乙酰化/去乙酰化和泛素化降解的蛋白降解调节［15］。因此对于缺氧诱导自噬与BMMSC诱导自噬产生不同效应的原因，我们猜测可能是由于这两者诱导的自噬过程中存在的调控方式有差异。RT⁃qPCR的结果则表明这两者对于自噬的调控并非在于基因转录的层面，而是在于蛋白水平的变化。由于Beclin⁃1⁃PI3K III复合体在早期自噬体形成时参与募集下游相关蛋白，因此Beclin⁃1蛋白与LC3蛋白的表达量上调可能存在一定的联系。

BNIP3作为凋亡相关Bcl⁃2蛋白家族的成员之一，是属于仅含有BH⁃3结构域的BH3⁃only亚族。缺氧时可检测到Bnip3蛋白的上调［16，17］。许多研究亦表明Bnip3蛋白可以诱导多种不同细胞的自噬上调，包括心血管系统的细胞。有文献报道Bnip3蛋白过表达显著地诱导HL⁃1心肌细胞［17］和成人心肌细胞自噬的发生。而显性抑制（突变无功能）的Bnip3蛋白的过表达则减少了模拟I/R的HL⁃1细胞的自噬水平，说明了Bnip3在这一类缺血缺氧过程中的自噬的诱导过程中有着重要的作用［18］。Zhang等人则发现缺氧过程中自噬的诱导需要通过缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor⁃1，HIF⁃1）介导Bnip3的生成［19］。该研究还表明，HIF⁃1在调节Bnip3生成的同时还通过ATG5和Bcelin⁃1负性调节缺氧状况下细胞线粒体的质量，诱导线粒体自噬的发生［19］。他们推断Bnip3可能通过诱导线粒体的损伤、线粒体自噬的发生从而去除受损的细胞器。Arad等人的研究则表明了Bnip3的siRNA表达减少了缺氧诱导自噬的水平［20］。然而，Papandreau等人在研究中却发现，在癌细胞系中缺氧诱导的自噬却并不依赖于Bnip3的表达，而是与AMPK的（Adenosine 5′⁃monophos⁃phate⁃activated protein kinase，AMP依赖性蛋白激酶）激活有关［21］。Bnip3与缺氧诱导自噬到底存在怎样的关系，这有待更多的后续研究来揭示。

Beclin⁃1蛋白是Bcl⁃2同源的仅含有BH⁃3结构域的蛋白，最初是存在于细胞质的内质网、线粒体以及核周膜上［22］。Beclin⁃1蛋白作为自噬途径之一的PI3K III复合物中的一员，参与了自噬体的形成和介导下游自噬相关蛋白在吞噬泡（phago⁃hore）膜上聚集［23］，因此在自噬过程中占有核心的地位。多项研究表明，自噬过程中Beclin⁃1蛋白的表达受到包括NFKB（Nuclear factor kB，核因子kB），E2F转录因子和miRNA在内的多种因素调控［24，25］。另外，Wang等人在多种细胞系中发现ERK（extracellular）信号通路通过调节Beclin⁃1的活性参与了自噬的诱导。在MSC诱导自噬的机制研究方面，Shin等首次在一个阿尔兹海默病（AD）模型中发现了MSC通过正性调节Beclin⁃1蛋白表达增强细胞自噬水平［26］，但并没有明确指出该种调节与任何自噬调节信号通路存在关联。碰巧的是，Sanchez等人在发现MSC对乳腺癌细胞的生存起到一个提供细胞外基质支撑的作用的同时，亦发现MSC通过增强包括Beclin⁃1在内的自噬关键调控蛋白的表达来维持癌细胞在营养缺乏情况下的生存［27］。由此看来，Beclin⁃1蛋白的上调可能是MSC通过自噬（准确来说是通过自噬体的形成）改善细胞生存的一个重要手段。

综上所述，BMMSC可诱导HCAECs产生自噬效应，使LC3蛋白及Beclin⁃1蛋白表达量上调，并在缺氧条件下可改善HCAECs的早期凋亡率，但其机制并不十分明确，需要进一步增加检测手段以及上下游蛋白、基因的变化情况，运用各种检测手段更加直观地观察自噬/自噬流的变化趋势。BMMSC诱导自噬与应激条件下诱导自噬对HCAECs产生的效应不同，其中究竟存在何种分子机制的差异，有待于进一步深入研究，为MSC应用于改善心血管疾病预后提供理论支持。

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Effect of bone marrow⁃derived mesenchymal stem cells on autophagy and apoptosis of human coronary artery endothelial cells under hypoxia condition

MA Xun1，LI Hongmu1，WANG Lueli2， TAO Jun1，LIN Xifeng1，HUA Ping1，XIONG Lihua1.1Department of Cardiac Surgery，Sun Yat⁃sen Memori⁃al Hospital，Sun Yat⁃Sen University，Guangzhou 510120，China；2Department of Cardiacvascular Surgery，Yan An Hospital，Kunming 650051，China.Corresponding author：XIONG Lihua，lihuax211@126.com

ObjectiveTo investigate whether mesenchymal stem cells lead to induction of autophagy and change at early apoptotic rate under hypoxia condition on coronary artery endothelial cells. MethodsWe constructed the co⁃culture model of HCAECs（human coronary artery endothelial cells）and hBMMSCs（human bone marrow⁃derived mesenchymal stem cells）.In experiment group，HCAEC co⁃cultured with MSC，HCAEC cultured alone in blank group.And in control group，HCAEC cultured alone using same medium with experiment group.Each group separately cultured 24 h under nomoxia（5%CO2，95%air）and hypoxia（1%O2，5%CO2，94%N2）condition.The HCAEC′s expression of LC3 and Beclin⁃1 at mRNA and protein level was detected by Real⁃Time PCR and Western blotting，respectively.Flow cytometry was used to detect early apoptotic rate.ResultsThe protein expression of LC3 and Beclin⁃1 in co⁃culture groups and hypoxia groups significantly higher than separate culture groups and nomoxia groups respectively（P＜0.05），while mRNA expression of LC3 and Beclin⁃1 in each group shows no difference（P＞0.05）.The early apoptotic rate of co⁃culture group under hypoxia was 8.86%±1.48%，which was significantly lower than those in separate culture group under hypoxia and con⁃trol group under hypoxia（15.23%±2.56%and 14.49%±3.31%，P＜0.05）.ConclusionMSC induces autophagy in HCAEC，along with decrease of early apoptosis rate of HCAEC under hypoxia condition.

bone marrow⁃derived mesenchymal stem cells；autophagy；hypoxia；human coronary artery endothelial cells；co⁃culture；apoptosis

R681.5

A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.02.002

2017⁃02⁃18）

广东省自然科学基金（06021339）

1510120广州中山大学孙逸仙纪念医院心脏外科；2650051昆明昆明市延安医院心脏大血管外科#共同第一作者

*通讯作者：熊利华，E⁃mail：lihuax211@126.com