黄秋葵多糖的体外抗氧化活性研究

张涛

摘要：以遵义黄秋葵为对象，制备了黄秋葵多糖，研究了其多糖成分的体外抗氧化活性。结果表明：黄秋葵多糖对DPPH、羟基自由基（·OH）和超氧负离子（O-2·）均具有良好的清除作用，与Fe2+有较强的螯合能力，并且黄秋葵多糖的抗氧化作用呈现一定的浓度依赖性。

关键词：黄秋葵；多糖；抗氧化活性

中图分类号：R285

文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2017）6-0194-02

1 引言

黄秋葵（Abelmoschus esculentus Moench）属锦葵科秋葵属，主要分布于热带、亚热带及温带，在我国贵州、湖北、湖南等地栽培面积较广，有蔬菜王的称呼，经济及食用价值较高[1，2]。现代药理学研究表明，黄秋葵在养胃、抗疲劳、抗肿瘤、保护心血管及免疫调节等方面具有较好的活性[3～5]。多糖作为植物中的一种重要生物大分子，具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等多种功能[6～8]，本文联合利用4种方法对黄秋葵多糖的体外抗氧化作用进行了研究，研究结果将为黄秋葵的综合开发利用提供理论支撑。

2 材料与方法

2.1 材料和试剂

从市场上采购黄秋葵，烘干至恒重；抗坏血酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠等常规化学试剂购于北京化工厂；辣根过氧化物酶（HRPase）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氯化硝基四氮唑（NBT）等购于Sigma。

2.2 仪器与设备

可见分光光度计（723型），上海光谱；电子分析天平（SL3001N），上海民桥；冷冻干燥器，北京博医康；电热恒温水浴锅，北京泰泽瑞达。

2.3 黄秋葵多糖的制备

称取干燥的黄秋葵500 g，置于装有8 L蒸馏水的容器中，100 ℃煮提4 h，过滤；重复煮提一次，过滤，合并二次的滤液。于65 ℃将多糖提取液浓缩至约700 mL，4500 r/min离心15 min，收集上清液并加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜。次日，4500 r/min离心15 min，收集沉淀并冻干。将冻干物复溶于700 mL的蒸馏水中，并向该溶液中加入除蛋白试剂（氯仿：正丁醇=4：1）200 mL，剧烈振荡2 h后，于4500 r/min离心15 min，收集水层，重复2次后，将上清溶液冻干，即得黄秋葵多糖。

2.4 黄秋葵多糖的糖含量、糖醛酸含量及蛋白质含量测定

分别采用苯酚-硫酸法、间羟基联苯法和考马斯亮蓝法分析多糖中的糖、糖醛酸和蛋白质含量[9]。

2.5 黄秋葵多糖的抗氧化活性测定

2.5.1 对DPPH的清除能力

将黄秋葵多糖溶于蒸馏水中，配成系列浓度的溶液（0.25～4.0 mg/mL）。上述多糖溶液各取4 mL与1 mL DPPH甲醇溶液（0.1 M）混合，混匀并避光反应20 min。以蒸馏水为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。DPPH清除率=（1-A黄秋葵多糖/A蒸馏水） × 100%，其中A黄秋葵多糖和A蒸馏水为各溶液在517 nm处的吸光值[10]。

2.5.2 对羟基自由基（·OH）的清除能力

将黄秋葵多糖溶于蒸馏水中，配成系列浓度的溶液（0.25～4.0 mg/mL）。上述多糖溶液各取0.1 mL，与0.4 mL磷酸盐缓冲液（0.05 M，pH=7.5），乙二胺四乙酸溶液（0.001 M）、H2O2（0.01 M），抗坏血酸溶液（0.002 M），脱氧核糖溶液（0.06 M），FeCl3溶液（0.001 M）各0.1 mL混合，于37 °C孵育1 h。向溶液中继续加入TFA溶液（10%）和1.0 mL硫代巴比妥酸溶液（1%）各1.0 mL，于100 °C孵育15 min。羟基自由基（·OH）清除率=（1-A黄秋葵多糖/A蒸馏水） × 100%，其中A黄秋葵多糖和A蒸馏水为各溶液在532 nm处的吸光值[11]。

2.5.3 对超氧负离子（O-2·）的清除能力

将黄秋葵多糖溶于蒸馏水中，配成系列浓度的溶液（0.25～4.0 mg/mL）。上述多糖溶液各取1 mL，加入氯化硝基四氮唑（300 μM）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（936 μM）、吩嗪硫酸二甲酯（120 μM）各1 mL混合，于25 ℃孵育5 min。超氧负离子（O-2·）清除率=（1-A黄秋葵多糖/A蒸馏水） × 100%，其中A黄秋葵多糖和A蒸馏水为各溶液在560 nm处的吸光值[12]。

2.5.4 与Fe2+的螯合能力

将黄秋葵多糖溶于蒸馏水中，配成系列浓度的溶液（0.25～4.0 mg/mL）。上述多糖溶液各取1 mL，与0.5 mL FeCl2（2 mM）、0.2 mL菲咯嗪溶液（2 mM）混合，于25 ℃孵育15 min。Fe2+螯合率=（1-A黄秋葵多糖/A蒸馏水） × 100%，其中A黄秋葵多糖/A蒸馏水为各溶液在562 nm处的吸光值[13]。

3 结果分析

3.1 黄秋葵多糖的制备

黄秋葵多糖的制备流程如图1所示，黄秋葵用8 L蒸馏水在100 ℃下连续煮提二次，过滤，合并二次滤液，浓缩至700 mL，80%乙醇醇沉后靜置过夜，离心后的沉淀经冻干和除蛋白质后，得到浅黄色的黄秋葵多糖37.5 g，收率约7.5%。分析黄秋葵多糖的糖含量约88.6%，糖醛酸含量约19.3%，蛋白质含量约0.9%。

3.2 黄秋葵多糖对DPPH的清除能力

DPPH是一种稳定的有机自由基，可以用来研究多糖对有机自由基的消除活性。黄秋葵多糖对DPPH的清除能力如图2所示，结果表明其具有较好的DPPH清除活性，且活性随着多糖浓度的增加而增强，呈现一定的浓度依赖性，EC50约为1.3 mg/mL。

3.3 黃秋葵多糖对羟基自由基（·OH）的清除能力

羟基自由基（·OH）是机体在代谢中产生的自由基，对机体有较大毒性，可以用来研究多糖对自由基的消除活性。黄秋葵多糖对羟基自由基（·OH）清除能力如图3所示，结果表明其具有一定的·OH清除能力，并且其活性随着多糖浓度的增加而增强，呈现出一定的浓度依赖性。

3.4 黄秋葵多糖对超氧负离子（O-2·）的清除能力

O-2·作为活性氧其中的一种，可以用来分析多糖对活性氧自由基的清除能力。黄秋葵多糖对超氧负离子（O-2·）的清除能力如图4所示，其具有一定的O-2·清除能力，并且活性随着多糖浓度的增加而增强，呈现一定的浓度依赖性，EC50约为3.5 mg/mL。

3.5 黄秋葵多糖与Fe2+的螯合能力

金属离子（如，二价铁离子）在机体的脂质氧化过程中有催化作用，通过检测多糖与金属的螯合作用，可以间接地反映其抗氧化作用。黄秋葵多糖与Fe2+的螯合能力图5所示，黄秋葵多糖都具有一定的螯合能力，并且螯合能力随着多糖浓度的增加而增强，呈现一定的浓度依赖性。

4 结论

本文通过热水煮提、醇沉、脱蛋白等步骤，制备了黄秋葵多糖，产率为7.5%；并利用4种检测方法，研究了黄秋葵多糖的抗氧化活性，其均表现出一定的抗氧化活性，且活性随着多糖的浓度增高而正确，呈现出浓度依赖性。实验结果将能够促进黄秋葵相关药物和功能食品的开发和利用。

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