甘草渣中黄酮提取物质量标准研究

刘效栓，李喜香，肖正国，李季文，罗燕燕

1.甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000

论著·中药研究与开发

甘草渣中黄酮提取物质量标准研究

刘效栓1，李喜香1，肖正国1，李季文1，罗燕燕2

1.甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000

目的建立甘草渣中黄酮提取物的质量标准，为甘草渣中提取的总黄酮提供质量控制的方法及依据。方法采用薄层色谱法将提取物与甘草苷及甘草对照药材对比鉴别，采用紫外分光光度法测定总黄酮含量，EDTA二钠滴定法测定钙离子含量。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，在与对照品相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。紫外分光光度法测定甘草苷在3.32～9.96 µg/mL范围内线性关系良好（r＝0.999 7），吸光度在0.3～0.7之间，平均加样回收率为102.41%（RSD＝3.22%），3批甘草渣黄酮提取物中总黄酮平均含量为8.82%，钙离子平均含量为0.107%（RSD＝3.61%）。结论本方法重复性好、灵敏度高、结果准确，可用于甘草渣中黄酮提取物的质量控制。

甘草渣；黄酮提取物；质量标准

甘草为豆科甘草属甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch、胀果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat.、光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎，有效成分复杂，主要为甘草酸和黄酮类化合物[1]，但目前开发、生产的主要是甘草中的甘草酸[2]，剩余物作为药渣弃去。研究表明，甘草渣中富含黄酮类化合物[3]，具有多种生物活性，除消炎、抗菌、抗变态反应等，在抗氧化、抗癌、防癌、防肿瘤及保肝护消化道等方面作用显著[4]。

近年来，随着对甘草药理作用的进一步认识，全球对甘草的需求日益增长，野生甘草资源急剧减少，与此同时，甘草提取甘草酸或甘草浸膏后剩余的残渣（甘草渣）也逐渐成为危害生态环境的又一物质。本课题前期进行了“基于化学转化法破壁富集甘草药渣中总黄酮的开发研究”（兰州市科技局，2014-2-32）。为了保证甘草渣黄酮提取物的质量稳定性，本研究参考2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）甘草项进行甘草渣黄酮提取物的研究，建立其薄层色谱鉴别法、总黄酮含量测定法及钙离子含量测定方法等质量标准，以期为甘草渣中黄酮资源的有效、合理开发和质量评价提供依据。

1 仪器与试药

UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津），AR124CN型电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司），SB-3200D型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司），ZXFD-A5140型全自动新型鼓风干燥箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）。

甘草饮片（甘肃康乐药业有限责任公司，批号150922、150701，经甘肃省药检院宋平顺主任药师鉴定为Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根和根茎），自制甘草流浸膏（批号 160301）、自制甘草渣（批号150922、150701）得黄酮提取物（批号 20160504、20160505、20150506），甘草对照药材（中国食品药品检定研究院，批号120904-201318），甘草苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号B20414），甲醇（批号20141023）、正丁醇（批号20130923）为色谱纯，含量测定用水为娃哈哈纯净水，提取用水为饮用水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

①取黄酮提取物1 g，加水适量，用0.2 mol/L稀盐酸调至pH＝3，定容至 40 mL，用正丁醇萃取3次，每次20 mL，萃取液蒸干，加甲醇5 mL溶解，为供试品。②取对照药材1 g，加乙醚40 mL回流1 h，药渣加甲醇30 mL回流1 h，滤液蒸干，残渣加水40 mL溶解，正丁醇萃取3次，每次20 mL，萃取液蒸干，甲醇5 mL溶解，为对照药材溶液。③取甘草苷对照品，加70%乙醇溶液，配成2 mg/mL的对照品溶液。④取甘草流浸膏1 g，加水40 mL，40 ℃水浴溶解，正丁醇萃取3次，每次20 mL，萃取液水洗3次，蒸干，残渣用甲醇5 mL溶解，为浸膏对照品。

照薄层色谱法（2015年版《中国药典》一部附录Ⅵ B），吸取上述4种溶液2 µL，分别点于同一氢氧化钠的硅胶 G薄层板，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色，置紫外灯254 nm波长下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，在与对照品相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 溶媒的选择 文献报道甘草总黄酮含量测定时，甘草苷对照品的配制用甲醇及不同浓度的乙醇作为溶媒[5-7]。本试验考察了甲醇及不同浓度的乙醇，发现样品在70%乙醇溶液中的溶解度大于甲醇溶液，并且在10%氢氧化钾溶液显色后，供试品溶液与对照品溶液光谱行为一致，故选择70%乙醇为溶媒。

2.2.2 样品溶液制备 取黄酮提取物约25 mg，精密称定，加70%乙醇超声处理（功率250 W，频率33 kHz）2 min，定容至50 mL，即得。

品牌创新能力的路径系数达到了0.92，说明其对新疆农产品区域品牌竞争力具有非常显著的作用。因此在品牌创新能力提升方面，首先应加强新疆农业技术创新，增加农业科研投入，加强先进适用技术的研发和推广；其次应加强农业管理创新，推动农业供给侧结构性改革，探索和优化农业管理体系；再次是加强农业发展的形象创新能力，应加强新疆农业标准化建设，实施农产品市场准入制度，确保农产品质量绝对安全，同时完善区域品牌保护机制，完善市场秩序，落实知识产权保护，促进专利技术转化实施，建设诚信体系，加大惩处违规者，营造新疆农产品区域品牌良好竞争环境。

2.2.3 对照品贮备液制备 精密称定甘草苷对照品8.30 mg，用70%乙醇溶解并定容至10 mL，即得。

2.2.4 测定波长选择 取对照品贮备液0.1 mL、样品贮备液0.5 mL，分别加10%氢氧化钾溶液0.1 mL，显色5 min，用70%乙醇稀释至10 mL，在波长800～200 nm扫描，记录λmax。结果表明，对照品溶液与样品溶液波形基本一致，在394、336、254 nm处有吸收峰，但394 nm样品峰随浓度的变化峰位不稳定，当上述样品溶液继续稀释10倍时，394 nm峰逐渐减小；而在对照品溶液中，当显色剂增加到1∶1.5（V/V）时，254 nm峰红移至276 nm。故选择对浓度相对稳定的336 nm为测定波长。

2.2.5 标准曲线的绘制 取对照品溶液2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加10%氢氧化钾溶液2.5 mL，放置5 min，用70%乙醇定容至刻度，精密吸取0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，在336 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程Y＝64.458X－0.004 8，r＝0.999 7。结果表明，对照品浓度在3.32～9.96 µg/mL范围内线性关系良好，吸光度在0.2～0.7之间。

2.2.6 精密度试验 取“2.2.4”项下样品溶液，在336 nm波长处连续测定5次，吸光度为0.654、0.655、0.655、0.654、0.653，平均值为0.654，RSD＝0.35%。

2.2.7 重复性试验 取样品溶液5份，每份0.2 mL，分别加10%氢氧化钾溶液0.2 mL，显色5 min，加70%乙醇定容至10 mL，在336 nm处测定吸光度，吸光度为 0.313、0.328、0.317、0.322、0.319，平均值为0.3198，RSD＝2.76%。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的黄酮提取物约5 mg，共5份，精密称定，分别加入对照品溶液1.0 mL，加70%乙醇适量超声2 min，定容至50 mL，取4 mL，置10 mL容量瓶中，加入10%氢氧化钾溶液1 mL，显色5 min，定容至刻度，在336 nm波长处测定吸光度，并计算含量，结果见表1。

表1 加样回收率试验

2.2.9 样品测定 取 3批样品（批号 20160504、20160505、20150506），各约 10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加70%乙醇超声2 min并定容至刻度，取0.5 mL，加入10%氢氧化钾溶液0.5 mL，显色5 min，定容至10 mL，在336 nm波长处测定吸光度，并计算含量，结果见表2。

表2 样品中总黄酮含量测定结果

2.3.1 Ca2+标准溶液（10 mmol/L）配制 精密称取氢氧化钙74 mg，加盐酸（1→2）溶解，加H2O稀释至100 mL，得10 mmol/L的Ca2+标准溶液[8]。

2.3.2 EDTA二钠滴定液配制与标定 精密称取EDTA二钠19.001 2 g，加H2O稀释至1000 mL，即得0.05 mmol/L滴定液。取于约800 ℃灼烧至恒重的基准物质ZnO 0.12 g，精密称定，加盐酸3 mL溶解，加水25 mL，加0.025%甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25 mL、氨-氯化铵缓冲液（pH＝10.0）10 mL，再加铬黑T指示剂少量，用本液滴定至由紫色变为纯蓝色，并将滴定结果用空白试验校正[9]。

2.3.3 样品测定 精密称取样品适量（2 g），加稀盐酸溶解后，用水稀释至100 mL，精密量取25 mL，置锥形瓶中，加水25 mL，与KOH溶液（1→10）5 mL使pH＞12，加钙紫红指示剂少许，用EDTA二钠滴定液（0.05 mol/L）滴定至颜色由紫红变为纯蓝。每毫升滴定液相当于2.041 8 mg钙。结果见表3。

表3 样品中钙离子含量测定结果（n＝5）

表3 样品中钙离子含量测定结果（n＝5）

批号 含量/% RSD/% 20160504 0.129±0.004 4 3.41 20160505 0.061±0.002 2 3.61 20160506 0.132±0.003 1 2.35

3 讨论

本试验参照 2015年版《中国药典》甘草项下薄层色谱法进行，操作简便、分离度好、图谱清晰、斑点明显，是控制甘草渣中黄酮提取物质量的有效方法。李玉平等[10]在研究中减去了样品用乙醚处理的步骤，直接用正丁醇提取。认为乙醚处理对照药材易在玻璃容器中糊化，难以过滤；挥去乙醚过程繁琐且对人体有一定危害。而改进后的方法既没有影响色谱斑点的检出，又解决了样品糊化粘附和过滤的问题，简化了操作流程，减少了对人体的危害。该改进重现性好，可以考虑在下一版药典中省略乙醚处理步骤。

2015年版《中国药典》未收载甘草总黄酮含量测定方法。文献报道甘草总黄酮含量测定方法众多，而以甘草苷为对照品、氢氧化钾为显色剂最为推荐，但选择的吸收波长各不相同。高红等[11]采用紫外分光光度法测定甘草总黄酮的含量，以甘草苷为对照品，10%氢氧化钾为显色剂，最大吸收波长407 nm；伍蔚萍等[5]同样以甘草苷为对照品，10%氢氧化钾为显色剂，最大吸收波长为 400 nm；程新宇等[12]对甘草地上部分的总黄酮含量测定方法进行筛选，选择测定波长400 nm；冯薇等[7]研究甘草总黄酮含量测定方法，甘草苷对照品及样品溶液经碱处理后，最大吸收波长为 334 nm；周斌等[13]采用紫外分光光度法测定甘草中总黄酮的含量，以10%氢氧化钾为显色剂，最大吸收波长为337 nm。本研究在预试验中做了大量筛选，发现随着浓度不断稀释，对照品溶液显色后的最大吸收波长蓝移。而要控制吸光度在0.3～0.7范围内，其浓度范围比较窄（3.32～9.96 µg/mL），最大吸收波长在336 nm处。

黄酮类化合物紫外吸收光谱系分子光谱，吸收带的位置易受多种因素的影响，其中溶剂的极性和 pH值是极为重要的影响因素[14]。体系的pH值对吸收光谱的影响非常明显。黄酮类化合物的酚羟基由于体系的pH值不同其解离情况不同因而产生不同的吸收光谱。本试验在最大吸收波长的考察中，pH值范围为12.8～13.2。相同的对照品显色后，由于浓度不同而有离解、缔合、与溶剂间相互作用，这可能是不同研究报道最大吸收波长不同的原因。

甘草渣中总黄酮提取采用破壁富集工艺，适合工业化大生产。在提取过程中使用了分离转化剂，生产过程中有少量钙离子残留，是无法避免的杂质。本试验采用2015年版《中国药典》中的EDTA二钠滴定法，该方法是在高锰酸钾法的基础上改进的。相对于高锰酸钾法，使用此方法测定钙含量有操作过程简便、分析速度快、配制试剂种类少、工作量小等优点。虽在判定其终点时稍有误差，但总体上对测试结果影响不大。虽有不少研究采用原子吸收光谱法测定钙含量，但存在仪器数量少、成本高、不普及的局限性。

综上，甘草渣黄酮提取物的质量标准采用薄层色谱鉴别、紫外分光光度法控制总黄酮含量，EDTA二钠滴定法测定钙离子含量。所建立的方法重复性好、灵敏度高、结果准确，能够有效控制甘草渣中黄酮提取物的质量，同时亦可用于黄酮提取物相关制剂的质量控制。

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Study on Quality Standard of Flavone Extracts in Licorice Residue

LIU Xiao-shuan1, LI Xi-xiang1, XIAO Zheng-guo1, LI Ji-wen1, LUO Yan-yan2(1. Pharmacy Department of Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, China; 2. Pharmacy College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo establish the quality standard of flavone extracts in licorice residue; To provide the methods and basis for the quality control of total flavonoids extracted from licorice residue.MethodsTLC was applied to compare the extracts with liquiritin and licorice; UV-spectrophotometry was used to measure the content of total flavones; EDTA-2Na titration was used to determine the content of calciumion.ResultsIn the chromatogram of the test product, the spots of the same color were displayed on the corresponding position of the control medicinal material, and the fluorescent spots of the same color were displayed on the corresponding position of the control product. UV-spectrophotometry showed glycyrrhizin had a good linear relationship in the range of 3.32–9.96 µg/mL (r=0.999 7), the absorbance between 0.3 and 0.7. The average recovery rate was 102.41% (RSD=3.22%), and the average content of total flavonoids in three batches of flavonoids extract was 8.82%. The average content of calciumion was 0.107% (RSD=3.61%).ConclusionThis method has good repeatability, high sensitivity and accurate results, and can be used for the quality control of flavonoids in licorice residue.

licorice residue; flavone extracts; quality standard

R284.1

A

1005-5304(2017)04-0067-04

2016-09-09）

（

2016-10-08；编辑：陈静）

兰州市科技局人才创新创业项目（2014-2-32）

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.017