醒鼻微乳温敏凝胶中丹皮酚在大鼠鼻黏膜的吸收研究

乔丽菲，孙承韬，李煌，徐伟，褚克丹，阙金花，郑健

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学，福建 福州 350122

醒鼻微乳温敏凝胶中丹皮酚在大鼠鼻黏膜的吸收研究

乔丽菲1，孙承韬1，李煌1，徐伟1，褚克丹1，阙金花1，郑健2

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学，福建 福州 350122

目的 通过对醒鼻微乳温敏凝胶中丹皮酚的大鼠鼻黏膜吸收进行研究，评价该药的黏膜吸收情况和剂型选择的合理性。方法通过大鼠鼻腔给药试验，对不同时间点丹皮酚的血药浓度进行测定。结果大鼠鼻腔给予醒鼻微乳温敏凝胶后，丹皮酚的生物利用度为78.68%，达到最大浓度（Cmax）0.340 4 µg/mL的时间为3 min，平均滞留时间为9.23 h；鼻腔给药的血药浓度达到Cmax后的变化情况与尾静脉注射丹皮酚类似；丹皮酚的血药浓度数据符合二室模型，权重为W＝1。结论醒鼻微乳温敏凝胶经鼻给药生物利用度较高，剂型选择合理。

醒鼻微乳温敏凝胶；丹皮酚；鼻腔吸收

醒鼻方是福建省人民医院名老中医黄守林主任的鼻腔局部用药经验方，其主要组成为徐长卿、冰片等，具有疏风清热、开窍醒鼻等功效，临床和药理研究均表明其对变应性鼻炎疗效显著[1-6]。方中君药徐长卿具有祛风化湿、止痛止痒等功效，丹皮酚是其主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗变态反应、免疫调节和镇痛等作用[7-8]。本课题组将醒鼻方制成温敏凝胶剂[9-11]，制剂以液体形式滴入鼻腔后，在鼻腔温度下胶凝成半固体，粘附在鼻黏膜上，滞留性、黏着性明显增强，能够有效防止药物流失，延长药物的作用时间，提高药物的生物利用度，同时也增强了患者用药的顺应性。在此基础上，本研究采用大鼠体内实验法研究醒鼻微乳温敏凝胶中丹皮酚的吸收动力学，旨在评价药物的鼻黏膜吸收情况，为中药新药开发和微乳温敏外用凝胶剂型的研发提供参考。

1 材料

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司），湘仪H-2050R高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），QL-861涡旋振荡器（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司），XS105电子分析天平（METTLER TOLEDO）。

丹皮酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110708-200506），中药醒鼻微乳温敏凝胶（自制，批号20130712），丹皮酚注射液（自制，批号20130715），生理盐水（福州海王福药制药有限公司），甲醇为色谱纯，水为自制超纯水，其余试剂均为分析纯。

SD大鼠18只，雌雄各半，体质量（250±10）g，6～8周龄，SPF级，上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK（hu）2007-0005，饲养环境室温23～25 ℃，湿度50%～70%，光照12 h明暗交替，喂以SPF级大鼠标准饲料，水经无菌过滤处理，正常摄水，分笼喂养。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 取丹皮酚对照品7 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为284.80 µg/mL的丹皮酚对照品贮备液；精密移取贮备液1 mL至20 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，即得14.24 µg/mL的丹皮酚对照品溶液。

2.1.2 内标溶液 取肉桂酸对照品6 mg，精密称定，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，即得浓度为312.00 µg/mL的肉桂酸内标贮备液；精密移取贮备液1 mL至20 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，即得15.60 µg/mL的肉桂酸内标溶液。

2.2 分析方法

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水（60∶40）；流速：0.8 mL/min；检测波长：274 nm；进样量：10 µL；柱温：30 ℃；采集时间：15 min。

2.2.2 血浆样品的处理 取血浆样品100 µL，加入内标溶液2 µL，加入甲醇200 µL，涡旋混合30 s，14 000 r/min离心10 min，分离上清液，于-20 ℃贮存备用。

2.2.3 专属性考察 取大鼠空白血浆100 µL加肉桂酸内标溶液和甲醇各2 µL、空白血浆100 µL加丹皮酚对照品溶液和肉桂酸内标溶液各 2 µL、含药血浆100 µL加肉桂酸内标溶液和甲醇2 µL，分别按“2.2.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样。色谱图见图1。结果表明，丹皮酚峰与内标峰分离良好，内源性物质不干扰测定。

2.2.4 线性关系考察 分别取“2.1.1”项下浓度为284.80 µg/mL的丹皮酚对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL至20 mL量瓶，甲醇稀释至刻度，配制得浓度分别为1.42、2.85、7.12、14.24、28.48、71.20、142.40 µg/mL的系列丹皮酚对照品溶液；取100 µL空白血浆7份，分别加2 µL上述系列对照品溶液，按“2.2.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，以丹皮酚浓度对丹皮酚和内标峰面积比值进行线性回归，得回归方程 Y＝2.786 7X＋ 0.026 4（r＝0.998 7）。结果表明，丹皮酚血药浓度在0.028 5～2.850 0 µg/mL范围内与峰面积和内标峰面积比值线性关系良好。

图1 大鼠血浆中丹皮酚HPLC图

2.2.5 加样回收率试验

2.2.5.1 提取回收率 取100 µL空白血浆6份，分别加入浓度为2.850 0 µg/mL（低浓度）、0.285 0 µg/mL（中浓度）、1.424 0 µg/mL（高浓度）的丹皮酚对照品溶液2 µL，按“2.2.2”项下方法处理后进样，另取与配制对照品血浆相同的丹皮酚对照品溶液，用流动相配制成相应浓度的丹皮酚溶液，不经处理直接进样[12]，将2组峰面积进行比较，测得低、中、高浓度丹皮酚血浆的平均提取回收率分别为73.71%±7.58%（n＝6）、77.93%±6.77%（n＝6）、73.93%±6.63%（n＝6），RSD分别为2.86%、3.15%、2.95%。

2.2.5.2 方法回收率 另取100 µL空白血浆6份，分别加入2 µL低、中、高浓度丹皮酚对照品溶液，按“2.2.2”项下方法处理后进样，将丹皮酚和内标峰面积比值代入“2.2.4”项下标准曲线，计算丹皮酚浓度及回收率[12]，测得低、中、高浓度丹皮酚的方法回收率分别为85.92%±4.41%（n＝6）、87.70%±2.59%（n＝6）、86.62%±2.20%（n＝6），RSD分别为2.53%、2.37%、2.32%。

2.2.6 精密度试验

2.2.6.1 方法精密度试验 制备丹皮酚血药浓度为0.285 0 µg/mL的样品，按“2.2.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下连续测定6次，计算得丹皮酚峰面积与内标峰面积比值RSD＝1.18%，表明HPLC测定丹皮酚血药浓度的精密度良好。

2.2.6.2 日内精密度 分别取低、中、高浓度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 µg/mL）的丹皮酚血浆样品各5份，按“2.2.2”项下方法处理，于1 d内，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算得低、中、高质量浓度样品丹皮酚峰面积与内标峰面积比值的 RSD分别为10.19 %、8.27 %、6.54 %。

2.2.6.3 日间精密度 连续3 d制备低、中、高浓度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 µg/mL）的丹皮酚血浆样品各5份，共 3批，按“2.2.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算得3批低、中、高质量浓度样品丹皮酚峰面积与内标峰面积比值的 RSD分别为13.23 %、9.34 %、6.87 %。

2.2.7 重复性试验 平行制备丹皮酚血药浓度为0.285 0 µg/mL的样品6份，按“2.2.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算得丹皮酚峰面积与内标峰面积比值的RSD＝1.88%，表明重复性良好。

2.2.8 检测限与定量限 通过 LC-20A高效液相色谱工作站，测得丹皮酚血浆样品的检测限（S/N＝3）为0.014 24 µg/mL。按“2.2.5.1”项下方法计算5份浓度为0.028 5 µg/mL的丹皮酚血浆样品的提取回收率为 82.32%，RSD＝16.36 %。因此，确定定量限（S/N＞10）为0.028 5 µg/mL。

2.2.9 不同温度的稳定性试验 分别取低、中、高浓度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 µg/mL）的丹皮酚血浆样品各5份，置室温1、2、4、6、24 h及1、2、4、7、14 d后取样，按“2.2.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算6 h内及6 d内低、中、高质量浓度的丹皮酚血浆样品中丹皮酚峰面积与内标峰面积比值的 RSD。同法考察丹皮酚血浆样品在4 ℃、-20 ℃的稳定性。结果见表 1。丹皮酚血浆样品在室温下放置，其含量变化较大；4 ℃放置14 d，含量略有变化；-20 ℃放置14 d，含量基本稳定。所以样品放置于-20 ℃保存，2周内测定。

表1 不同温度下丹皮酚血浆样品的稳定性RSD（%，n＝5）

2.3 醒鼻微乳温敏凝胶的大鼠鼻腔吸收动力学

2.3.1 丹皮酚注射液的配制 首先配制 88%氯化钠注射液、10%乙醇和2 %吐温-80的混合溶液，再用上述混合溶液配制浓度为2.6 mg/mL的丹皮酚溶液，过0.45 µm微孔滤膜，即得丹皮酚注射液。

2.3.2 大鼠鼻腔吸收实验 将18只SD大鼠随机分为空白组、丹皮酚注射液组、醒鼻微乳温敏凝胶组，实验前禁食不禁水12 h。动物用15%乌拉坦（5 mL/kg）浅度麻醉后，空白组和醒鼻微乳温敏凝胶组分别经鼻腔给予生理盐水和醒鼻微乳温敏凝胶（50 mg×2，约47 µL×2，丹皮酚含量2.74%，凝胶给药剂量0.4 g/kg），丹皮酚注射液组经尾静脉注射丹皮酚注射液 0.1 mL（丹皮酚给药剂量1.04 mg/kg），给药后0.017、0.05、0.08、0.17、0.33、0.5、1、2、4、8、12、24 h眼眶取血0.3～0.5 mL于含肝素的采血管中，12 000 r/min离心10 min，分离上清液，得血浆，取100 µL，按“2.2.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，并按“2.2.4”项下标准曲线计算血浆样品中丹皮酚的浓度，绘制血药浓度-时间曲线（见图 2）。用DAS1.0软件处理血药浓度数据，主要药动学参数见表2。由结果可知，醒鼻微乳温敏凝胶大鼠鼻腔给药后，丹皮酚的生物利用度为 78.68%，达到最大浓度（Cmax）0.340 4 µg/mL的时间为3 min；平均滞留时间为9.23 h，大鼠尾静脉注射丹皮酚的平均滞留时间为8.89 h；鼻腔给药的血药浓度在达到Cmax之后，变化情况与尾静脉注射丹皮酚类似；丹皮酚的血药浓度数据均符合二室模型，权重为W＝1。

图2 大鼠给药后丹皮酚的药时曲线

表2 大鼠给药后主要药动学参数

3 讨论

本研究比较了甲醇和乙腈的除蛋白效果，发现甲醇处理后的血浆样品丹皮酚峰高于乙腈处理后的血浆样品丹皮酚峰，而且溶剂峰低于乙腈处理后的血浆样品的溶剂峰，因此，本试验选用甲醇除蛋白。

测定血浆样品中的成分时，本研究比较了有机试剂沉淀蛋白后直接离心与挥干有机试剂再定容2种方法处理生物样品的丹皮酚回收率，发现加入2倍血浆量的甲醇能够达到较高的回收率，原因可能为丹皮酚为易挥发成分，易在挥干有机试剂时损失。

醒鼻微乳温敏凝胶常温下为有一定黏度的可流动液体，不易直接测量体积，因此，在醒鼻微乳温敏凝胶的制备及大鼠鼻腔给药时，均通过质量来确定其取样量。

[1] 褚克丹,郑健,黄郑隽,等.中药醒鼻凝胶滴剂治疗豚鼠变应性鼻炎的疗效观察[J].福建中医药,2008,39(3)：43-45.

[2] 郑健,褚克丹,艾斯,等.中药醒鼻凝胶滴剂治疗变应性鼻炎的药效学研究[J].中华中医药杂志,2009,24(4)：460-463.

[3] 郑健,罗海燕,艾斯,等.中药醒鼻凝胶滴剂治疗小儿变应性鼻炎 50例疗效观察[J].福建中医药,2010,41(1)：3-4.

[4] 陈岩,黄枚,褚克丹,等.醒鼻凝胶剂对变应性鼻炎模型豚鼠的作用机制[J].福建中医药大学学报,2013,23(3)：23-25.

[5] 陈燕,南丽红,向青,等.醒鼻凝胶剂对变应性鼻炎豚鼠胸腺基质淋巴细胞生成素表达的影响[J].中医学报,2015,31(8)：1163-1165.

[6] 南丽红,向青,徐伟,等.醒鼻凝胶剂对变应性鼻炎豚鼠核转录因子-κB信号通路的影响[J].中华中医药杂志,2016,31(2)：441-444.

[7] 李骅,王四旺,张邦乐.丹皮酚的药理活性和药物动力学研究进展[J].亚太传统医药,2010,6(2)：110-112.

[8] 杨正生,彭振辉,姚青海,等.丹皮酚的药理作用研究进展[J].中国药物与临床,2011,11(5)：545-547.

[9] 吕凤芹,李煌,徐伟,等.基于中药醒鼻方的丹冰自微乳化给药系统的制备[J].药学学报,2013,48(10)：1602-1610.

[10] 褚克丹,李煌,郑健,等.中药醒鼻温敏凝胶的制备及其体外释放度研究[J].中国中药杂志,2010,35(21)：2822-2825.

[11] 潘旭东,林雄,黄燕,等.醒鼻温敏凝胶的质量控制[J].福建中医药大学学报,2013,23(1)：43-45.

[12] 贾静,南峰,梁茂植,等.高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中阿折地平浓度及药动学[J].中国医院药学杂志,2010,30(24)：2088-2091.

Study on Nasal Mucosa Absorption of Paeonol of Xingbi Microemulsion-based Thermo-sensitive Gel in Rats

QIAO Li-fei1, SUN Cheng-tao1, LI Huang1, XU Wei1, CHU Ke-dan1, QUE Jin-hua1, ZHENG Jian2(1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China; 2. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China)

ObjectiveTo study the nasal mucosa absorption of paeonol of Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel in rats; To evaluate the nasal mucosa absorption of medicine and the rationality of preparation form.MethodsAccording to the nasal administration method, the blood medicine concentration of paeonol was determined at different time points.ResultsThe nasal administration bioavailability of paeonol in Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel was 78.68%, the plasma concentration reached the maximum (0.340 4 µg/mL) after 3 min of administration, and the average residence time was 9.23 h. After reaching Cmax, The plasma concentration changed similar to intravenous administration of paeonol. The concentration data of paeonol in plasma was consistent with a two-compartment model, with a weight of 1.ConclusionXingbi microemulsion-based thermosensitive gel has a higher bioavailability, and the preparation form was reasonable.

Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel; paeonol; nasal absorption

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.022

R285.5

A

1005-5304(2017)04-0088-04

2016-10-13）

（

2016-10-28；编辑：陈静）

福建省科技计划项目（2013Y4004）

褚克丹，E-mail：chukd5917@163.com