HPLC同时测定红花药材中4种化学成分含量

何婷，李柯翱，季志红，田树革

1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆奇康哈博维药股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830026；3.新疆医科大学中心实验室，新疆 乌鲁木齐 830011

HPLC同时测定红花药材中4种化学成分含量

何婷1，李柯翱2，季志红2，田树革3

1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆奇康哈博维药股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830026；3.新疆医科大学中心实验室，新疆 乌鲁木齐 830011

目的 建立HPLC同时测定红花药材中羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、山柰素4种化学成分含量的方法。方法采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），DAD检测器，以0.5%磷酸溶液（A）-甲醇（B）进行梯度洗脱，柱温为30 ℃，流速为0.8 mL/min，进样量为10 µL，检测波长为360 nm。结果 羟基红花黄色素A在0.077 6～0.776 0 µg（r＝0.999 9）、芦丁在0.046 0～0.460 0 µg（r＝0.999 6）、槲皮素在0.006 4～0.064 0 µg（r＝0.999 9）、山柰素在0.012 8～0.128 0 µg（r＝0.999 7）范围内呈良好线性关系。羟基红花黄色素 A、芦丁、槲皮素、山柰素的平均回收率分别为 99.68%、99.78%、102.03%、97.03%，RSD（n＝6）分别为2.29%、1.52%、1.02%、2.05%。结论该法简便、准确，灵敏度高，稳定性和重复性好，可用于红花药材的质量控制。

红花；羟基红花黄色素A；芦丁；槲皮素；山柰素；高效液相色谱法

红花为菊科红花属植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，始载于《开宝本草》，在我国已有多年栽培和药用历史，主要分布在新疆、河南、四川、云南、浙江等地[1]。红花具有活血化瘀、散瘀止痛、降血压和降血脂等功效[2]。《本草纲目》记载，红花能“活血润燥，止痛散肿，通经”。临床和药理研究发现，红花对心脑血管系统、神经系统、免疫系统等均可发挥一定作用，同时具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生理活性[3-5]。

红花的化学成分有黄酮、生物碱、聚炔、有机酸和多糖等，其中以黄酮类化合物（红花黄色素）为主要有效成分[6-9]。2015年版《中华人民共和国药典》[10]仅对红花中的羟基红花黄色素 A和山柰素进行了含量测定，未对其他成分进行研究。为更好开发和合理利用红花资源，本试验以新疆红花为研究对象，采用HPLC同时测定红花药材中4种化学成分含量，为有效控制药材质量、提高红花质量标准提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1220 LC高效液相色谱仪、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），美国Agilent公司；WondaSil C18 Superb色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），岛津技迩（上海）商贸有限公司；Waters 2690-2487型高效液相色谱仪，美国Waters公司；Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），北京迪马科技有限公司；火星牌O型玻璃仪器气流烘干器，郑州长城科工贸有限公司；KQ-5200DE型数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；FW-200高速万能粉碎机，天津泰斯达公司；XS105型万分之一电子天平，德国梅特勒-托利多仪器有限公司；B-260型水浴锅，上海亚荣生化仪器厂。

羟基红花黄色素A、芦丁、山柰素对照品（批号分别为 111637-200905、100080-200707、110861-201310），中国食品药品检定研究院；槲皮素对照品（批号YA0806YB13），上海源叶生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯，天津市富宇精细化工有限公司；水为超纯水。红花药材（S1为2015年产于新疆吉木萨尔县，S2为2015年产于新疆塔城县，购自新疆奇康哈博维药股份有限公司；S3为2016年产于新疆霍城县，购自安徽济顺中药饮片有限公司；S4为2016年产于新疆吉木萨尔县，S5为2016年产于新疆塔城县，购自国药集团新疆新特克拉玛依药业有限公司；S6为2016年8月采摘于和田墨玉县），经新疆医科大学中医学院中药鉴定教研室徐海燕副教授鉴定为菊科红花属植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 µm）；流动相：0.5%磷酸溶液（A）-甲醇（B）进行梯度洗脱（0～10 min，40%～40%B；10～15 min，40%～45%B；15～20 min，45%～50%B；20～45 min，50%～50%B）；流速：0.8 mL/min；进样量：10 µL；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃。在该色谱条件下，理论塔板数按羟基红花黄色素A峰计算不低于3000。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取经105 ℃干燥2 h后的羟基红花黄色素A对照品、芦丁对照品、槲皮素对照品、山柰素对照品适量，加甲醇制成含羟基红花黄色素A 77.6 µg/mL、芦丁46.0 µg/mL、槲皮素6.4 µg/mL、山柰素12.8 µg/mL的混合对照品溶液，经0.45 µm微孔滤膜过滤，即得。

图1 红花中4种化学成分HPLC图

2.3 供试品溶液的制备

取红花药材S1粉末（过3号筛）约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液30 mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液（15→37）10 mL，摇匀，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，转移至50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，经0.45 µm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2”项下混合对照品溶液0.5、1.0、2.5、3.5、4.0、5.0 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”色谱条件进行分析。以对照品进样量（µg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，计算羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、山柰素的线性范围，结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积。计算得羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、山柰素峰面积的RSD依次为 0.57%、0.47%、0.68%、0.52%，结果表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密称取红花药材样品（S1）1份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，测定峰面积，计算得羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、山柰素峰面积的RSD分别为2.45%、1.69%、1.75%、2.37%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取红花药材样品（S1），按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定并计算。羟基红花黄色素A平均含量为5.68 mg，RSD＝1.07%；芦丁平均含量为 1.96 mg，RSD＝0.90%；槲皮素平均含量各0.20 mg，RSD＝1.31%；山柰素平均含量为0.39 mg，RSD＝0.74%。结果表明本方法重复性良好。

2.8 耐用性试验

将供试品溶液用不同的色谱柱（WondaSil C18 Superb色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱和Diamonsil C18色谱柱）及不同的仪器（Agilent 1220 LC和Waters 2690-2487型高效液相色谱仪）进行测定，其他条件均保持一致。结果表明，不同色谱柱和仪器都能将红花药材中的4种化学成分依次分离。

2.9 加样回收率试验

称取6份已知含量的同一批红花药材S1粉末（过3号筛），每份约0.75 g，分别精密加入一定量的羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、山柰素对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率，结果见表2～表5。

表2 红花中羟基红花黄色素A加样回收率试验

表3 红花中芦丁加样回收率试验

表4 红花中槲皮素加样回收率试验

表5 红花中山柰素加样回收率试验

2.10 样品含量测定

取6批新疆不同产地的红花药材，按“2.3”项下方法制备，在“2.1”项色谱条件下测定其峰面积，分别代入线性回归方程，计算羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、山柰素4种成分的含量，结果见表6。

表6 红花样品中4种成分含量测定结果（n＝3）

3 讨论

在提取方法和溶剂选择上，根据2015年版《中华人民共和国药典》[10]，本研究分别采用25%甲醇直接超声提取及 100%甲醇回流提取，盐酸酸化后再进行回流提取，结果表明，在相同色谱条件下，后者色谱峰较多，分离度较好。因此，选择 100%甲醇回流提取后盐酸调节再进行回流提取的方法。

在波长的确定上，本研究参考相关文献[11-12]，结合指标成分的结构特征，采用DAD检测器，分别得到各特征峰的紫外光谱图，对4种混合对照品和红花样品进行分析，发现羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、山柰素在360 nm处均有吸收，各峰峰形良好，综合考虑确定检测波长为360 nm。

红花主要成分为黄酮类化合物，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。在流动相的选择上，参考相关文献[11-12]，分别采用不同比例甲醇-0.5%磷酸、乙腈-0.5%磷酸和甲醇-乙腈-0.7%磷酸进行等度和梯度洗脱。结果表明，以甲醇-0.5%磷酸为流动相进行梯度洗脱，各化合物的保留时间幅度小且分离效果良好。故本研究选择甲醇-水作为流动相。

本试验采用HPLC-DAD同时对红花药材中羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素、山柰素4种化学成分的含量进行测定，保留时间分别在5、13、27、39 min左右。该方法操作简单、灵敏度高、重复性好，分离度＞1.5，实现了红花药材中不同类型成分的同时测定，为更好地控制红花药材质量及进一步研究提供了依据。

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Simultaneous Determination of Four Chemical Components in Carthamus tinctorius L. by HPLC

HE Ting1, LI Ke-ao2, JI Zhi-hong2, TIAN Shu-ge3(1. College of TCM, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2. Xinjiang Ciconhabo Uygur Medicine Co. Ltd., Urumqi 830026, China; 3. Central Laboratory of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of hydroxysafflor yellow A, rutin, quercetin, and kaempferol in Carthamus tinctorius L..MethodsThe Agilent ZORBAX SB-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) was used with diode array detection. The mobile phase was 0.5% phosphoric acid (A) and methanol (B) to separate the four components by gradient elution at 30 ℃; the flow rate was 0.8 mL/min; the injection volumn was 10 µL; the detection wavelength was at 360 nm.ResultsThe linear ranges of hydroxysafflor yellow A, rutin, quercetin, and kaempferol were 0.077 6–0.776 0 µg (r=0.999 9), 0.046 0–0.460 0 µg (r=0.999 6), 0.006 4–0.064 0 µg (r=0.999 9) and 0.012 8–0.128 0 µg (r=0.999 7), respectively. The average recoveries of four components were 99.68% with RSD=2.29% (n=6), 99.78% with RSD=1.52% (n=6), 102.03% with RSD=1.02% (n=6), 97.03% with RSD=2.05% (n=6), respectively.ConclusionThe method is convenient, accurate, sensitive, stable and repeatable, which can be a method for quality control of Carthamus tinctorius L..

Carthamus tinctorius L.; hydroxysafflor yellow A; rutin; quercetin; kaempferol; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.020

R284.1

A

1005-5304(2017)04-0079-04

2016-07-25）

（

2016-08-27；编辑：陈静）

乌鲁木齐市科学技术计划（Y141310023）

田树革，E-mail：tsgyz@sina.com