宫颈癌中SLC39A6基因表达及其调节上皮间质转化的研究*

江 俊，刘 腾，吴东明，许 颖Δ.成都医学院第一附属医院 病案室(成都 60500)；.成都医学院第一附属医院 检验科(成都 60500)

·论 著·

宫颈癌中SLC39A6基因表达及其调节上皮间质转化的研究*

江 俊1，刘 腾2，吴东明2，许 颖2Δ
1.成都医学院第一附属医院 病案室(成都 610500)；2.成都医学院第一附属医院 检验科(成都 610500)

目的 研究SLC39A6在宫颈癌中表达的临床意义及其对宫颈癌细胞功能的影响。方法 基于GEO数据库中已有数据对SLC39A6在正常组织及肿瘤组织中的表达进行meta分析，继而在组织芯片上进行验证。通过TCGA数据库中数据对SLC39A6表达与宫颈癌患者的生存期进行相关性分析。通过RNAi技术结合慢病毒技术，对人宫颈癌细胞(Hela)中SLC39A6进行稳定干扰，研究SLC39A6基因干扰对宫颈癌细胞上皮间质转化(EMT)及转移能力的影响。结果 通过GEO数据集和TCGA数据库中分析表明，宫颈癌组织中SLC39A6表达明显高于正常组织，且SLC39A6基因表达与患者总生存期及无病生存期呈负相关。干扰SLC39A6可明显抑制宫颈癌细胞上皮间质转化及转移能力。结论SLC39A6与宫颈癌发生发展密切相关，SLC39A6可调控宫颈癌细胞转移，进而影响宫颈癌患者预后，表明SLC39A6可作为潜在的宫颈癌诊断标志物及治疗靶点。

宫颈癌；SLC39A6；标志物；上皮间质转化

全球每年约50万女性被诊断患有宫颈癌，其中近一半患者死亡，死亡率在女性恶性肿瘤中排列第2[1]。临床数据表明淋巴结转移的宫颈癌患者较未发生淋巴结转移的宫颈癌患者的生存率低20%～30%[2]，故宫颈癌转移相关基因与机制是研究热点。

SLC39A6基因位于染色体18q12.2上，编码锌转运载体蛋白LIV-1。锌作为一种人体必需的微量元素，在肿瘤发生、机体免疫等过程中均发挥重要作用。锌的胞内水平通过锌转运载体的表达进行调控[3]。SLC39A6基因在维持锌平衡中起着关键作用，因此对于肿瘤的发生过程至关重要[4]。现有研究表明，SLC39A6作为重要的锌转运载体，可通过调节胞内锌的含量发挥其广泛的生物学功能；大量研究[5-6]表明，SLC39A6在肿瘤细胞的生物学功能中发挥着重要作用，如SLC39A6与肝癌细胞中E-cadherin呈负相关，可通过SLC39A6/SNAIL信号通路促进肝癌转移，表明其可能在肿瘤转移及EMT进程中具有调控作用。食道鳞癌研究[7-9]也表明其与患者生存期呈明显负相关，可作为有效的食道癌诊断及治疗靶标。抗体偶联药物(antibody-drug conjugate, ADC)作为近来新兴的生物治疗药物，由于其特异性与肿瘤细胞结合，副作用小，因而被广泛研究[10-11]。针对SLC39A6靶标的ADC药物(SGN-LIV1A)在乳腺癌及宫颈癌体内外实验中均表现出良好的抗肿瘤活性[12]，然而，SLC39A6在宫颈癌中对于肿瘤转移的功能及具体机制尚不明了，仍需进一步深入研究。

基因表达数据库(GEO)及肿瘤基因图谱(TCGA)数据库作为重要的肿瘤基因数据库，覆盖基因表达及突变、临床病理资料、患者生存期等多种具有严格质量控制的数据，近年来得到广泛检索及运用[13]。Meta分析作为结合多个研究的统计学分析方法，可有效增加权重、提高评估规模，进而解决评估的不确定性[14]。基于GEO数据库中包含的高统量芯片及测序数据，结合meta分析，可有效进行肿瘤相关基因临床意义的评价[15-16]。

1 对象与方法

1.1 GEO数据分析

筛选GEO数据库中包含宫颈癌“Cervical cancer”及正常组织“Normal tissue”的数据集，初步筛选得到1 207个数据集。结合数据集简介及样本情况，共筛选得到7个包含正常宫颈组织及宫颈癌组织的数据集。下载上述数据集原始数据，基于R语言工具提取SLC39A6基因表达数据。Meta分析使用Revman 5.3软件完成。

1.2 TCGA数据分析

下载TCGA-CESC(Cervical squamous cell carcinoma)数据，基于Perl语言对原始数据进行整合及基因注释。后续基于R语言工具对SLC39A6基因表达与患者生存期进行相关性分析。

1.3 免疫组化染色

采用SLC39A6抗体(武汉三鹰生物)(1∶100)用于免疫组化检测组织中SLC39A6的表达情况；采用组织芯片(陕西超英)进行免疫组化染色[17]，在光学显微镜下观察并采集图像。

1.4 细胞培养

Hela细胞购买于ATCC。培养基于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养，在37 ℃，含5% CO2的孵箱中培养。

1.5 Hela细胞SLC39A6基因干扰

SLC39A6基因干扰套装由广州锐博生物进行合成(表1)，根据Lipofectamine 3000 Reagent提供的瞬时转染说明书上的操作步骤来转染Hela细胞，培养48 h后收集细胞。

1.6 腺病毒构建SLC39A6干扰稳定Hela细胞株

选取SLC39A6有效干扰序列，化学合成后，合成腺病毒干扰质粒，包装腺病毒由上海吉满生物完成。六孔板每孔加入10 μLSLC39A6干扰腺病毒浓缩液，感染2 d后，加入0.5 μg/mL G418，经2周筛选后得到SLC39A6腺病毒干扰的稳定细胞株。

1.7 Transwell

将Hela细胞铺板于六孔板中，37 ℃培养过夜后，进行SLC39A6干扰，做transwell实验[17]，隔夜风干后，揭下transwell小室膜，用中性树胶封片于载玻片上，待中性树胶风干后，于正置显微镜下记取5个视野的细胞数，并进行统计。

1.8 免疫荧光

首先吸净六孔板中的细胞培养基，进行细胞固定，细胞打孔10 min，进行免疫荧光染色[17]，将盖玻片倒置于预先加入10%甘油的载玻片上(含细胞面朝下)，置于正置荧光显微镜下观测并拍照。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 Meta分析正常子宫颈和宫颈癌组织中SLC39A6的表达

通过整理GEO数据库中包含宫颈癌正常组织及肿瘤组织的数据集(表1)，基于meta分析研究表明SLC39A6在宫颈癌组织中的表达水平明显高于正常宫颈组织，差异有统计学意义(P<0.001)(图1A)。通过组织芯片免疫组化分析，验证表明宫颈癌组织中SLC39A6表达明显高于正常宫颈组织(Scale bar=100 μM)(图1B)。TCGA数据分析SLC39A6基因表达与宫颈癌患者预后(图1C)。

表1 SLC39A6基因干扰序列信息

图1 Meta分析正常子宫颈和宫颈癌组织中SLC39A6的表达

注：A： Meta分析正常子宫颈和宫颈癌样本中SLC39A6的差异表达；B：正常宫颈和宫颈癌组织芯片免疫组化结果；C：TCGA数据分析宫颈癌患者生存曲线，OS(P=0.031)，DFS(P=0.009)

2.2 运用腺病毒载体构建SLC39A6干扰稳定Hela细胞株

通过锐博生物构建的SLC39A6 siRNA序列筛选，发现3号干扰序列具有最高的抑制效率(约50%)(F=12.80，P=0.002)(图2A)；继而通过吉满生物将该序列通过体外合成连接到腺病毒干扰载体上，成功构建GFP标记的SLC39A6干扰腺病毒，得到的腺病毒病毒滴度较高，HelaSLC39A6干扰稳定细胞株干扰效率达95%(Scale bar=50 μM)(图2B)。

2.3 稳定干扰SLC39A6可抑制宫颈癌细胞的转移能力

稳定细胞株研究表明，干扰SLC39A6后，CCK-8实验表明干扰SLC39A6对Hela细胞增殖无明显影响(图3A)。Transwell实验表明干扰SLC39A6，Hela细胞转移能力明显降低(图3B，3C)。

2.4 稳定干扰SLC39A6可降低宫颈癌细胞的上皮间质转化

上皮间质转化与宫颈癌细胞的转移能力密切相关，进一步研究干扰SLC39A6能否影响宫颈癌细胞的上皮间质转化进程发现，干扰SLC39A6可明显上调E-cadherin，下调N-cadherin、Vimentin的表达(Scale bar=50 μM)(图4)，表明干扰SLC39A6可抑制宫颈癌细胞的上皮间质转化；SLC39A6稳定干扰可明显调节EMT相关标志蛋白的表达，抑制宫颈癌细胞EMT的发生。

图2 SLC39A6 siRNA干扰效率检测注：A：siRNA干扰序列干扰后q-PCR定量结果；B：病毒感染细胞后，细胞免疫荧光结果

图3 稳定干扰SLC39A6对宫颈癌细胞增殖及转移的影响

注：A:CCK-8实验检测干扰SLC39A6对Hela细胞增殖的影响(P=0.186)；B:Transwell实验检测干扰SLC39A6的Hela细胞转移能力的影响；C:Transwell统计分析(P=0.006)

3 讨论

SLC39A6基因属于有锌转运结构特征的蛋白家族[18]，其对锌指蛋白SNAIL的核定位必不可少[19]；SNAIL作为一个癌症转移的主要调节器[20]，其下游感受器可调节E-cadherin的表达[21]，表明SLC39A6可通过SNAIL蛋白调节肿瘤的上皮间质转化进程。有研究[22-23]表明，在肝癌细胞中，SLC39A6与E-cadherin呈负相关，说明其可能在肿瘤转移及EMT进程中具有调控作用；SLC39A6基因已被证明可调节乳腺癌和前列腺癌的侵袭和转移进程。

近来，Meta分析作为一种统计学分析方法，通过联合多个GEO数据库数据分析，进而明确基因表达的临床意义，得到广泛应用。基于分子指标诊断的特异性和敏感性，meta分析可作为一种新型生物标志物筛选的方法，其不仅可以验证正常组织与肿瘤组织之间感兴趣分子指标的表达差异，还可以验证基因表达与肿瘤患者预后的关系；同时，基于多样本、多系统、多平台的meta分析在肿瘤分子标志物筛选中具有良好的应用潜力[24-25]。本研究通过meta分析系统性评价多个宫颈癌相关研究，发现宫颈癌组织中SLC39A6的表达明显高于正常宫颈组织；同时，本研究通过宫颈癌组织芯片免疫组化染色对meta分析结果予以验证。Meta分析及免疫组化染色均表明宫颈癌组织中SLC39A6的表达高于正常宫颈组织，具有统计学差异。TCGA生存期数据表明，SLC39A6表达与宫颈癌患者总生存期及无病生存期均呈负相关，表明SLC39A6与宫颈癌的发生及预后密切相关，具有潜在的临床应用价值，可作为潜在的宫颈癌预后标志物，预测宫颈癌患者预后。

图4 干扰SLC39A6对宫颈癌细胞上皮间质转化的影响

宫颈癌患者的不良预后与其转移具有直接关系，约90%的肿瘤患者死亡均归因于肿瘤转移。宫颈癌转移以直接侵犯和淋巴转移为主，晚期可转移到肺、肾等[26]。前期研究表明SLC39A6的表达与宫颈癌患者生存期呈明显相关性，而宫颈癌的增殖、转移等多种生物学功能均可能会影响患者预后。本研究对构建的SLC39A6稳定干扰宫颈癌细胞株进行细胞增殖及转移能力的检测结果显示，SLC39A6稳定干扰对宫颈癌细胞增殖能力无明显影响，而明显抑制其转移潜力。

综上所述，本研究通过SLC39A6与宫颈癌患者生存期的相关性研究及在宫颈癌细胞中相应的生物学功能研究发现，宫颈癌组织中SLC39A6的表达明显高于正常宫颈组织，干扰SLC39A6可明显抑制宫颈癌细胞转移能力及上皮间质转化进程，进而影响宫颈癌患者预后，表明SLC39A6的表达与宫颈癌的转移能力密切相关，揭示SLC39A6可作为潜在的宫颈癌诊断标志物及治疗靶点。

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Research on the Expression ofSLC39A6 and Its Effect on Epithelial-mesenchymal Transition in Cervical Cancer

JiangJun1,LiuTeng2,WuDongming2,XuYing2Δ.

1.Medical-recordDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.ClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To investigate the expression ofSLC39A6 and its effect on the cell function in cervical carcinoma. Methods The expression ofSLC39A6 in cervical carcinoma was analyzed by the meta-analysis on the basis of the existing data in the GEO database and verified on the tissue chips. The TCGA database was used to analyze the relationship between theSLC39A6 expression and the survival time of patients with cervical cancer. RNAi combined with the lentivirus technology was used to investigate the effect ofSLC39A6 on the epithelial mesenchymal transition (EMT) and the metastatic ability of cervical cancer cells by interfering with the stability ofSLC39A6. Results The study of GEO and TCGA databases showed that the expression ofSLC39A6 in the tumor tissues was significantly higher than that in the normal tissues, and it was negatively correlated with the survival time of patients with cervical cancer. The interference ofSLC39A6 obviously inhibited the EMT and metastatic ability of cervical cancer cells. ConclusionSLC39A6 is closely related to the occurrence and development of cervical cancer. The inhibition ofSLC39A6 can block the metastasis of cervical cancer cells and further affect the prognosis of patients with cervical cancer, which indicates thatSLC39A6 can be used as a potential diagnostic marker for cervical cancer and the therapeutic targets.

Cervical cancer;SLC39A6; Markers; Epithelial-mesenchymal transition

*通信作者：四川省教育厅资助项目(No:15ZA0264；15ZB0245)；四川省教育厅高校科研创新团队、成都医学院科研创新团队资助项目(No:CYTD15-03)；四川省卫生和计划生育委员会资助项目(No:16ZD040)

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170321.0916.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.02.005

R737.33

A

△通信作者：许颖，E-mail：yingxu825@126.com