中药单体白花丹醌对替加环素耐药鲍曼不动杆菌的抗菌作用研究*

张 驰，贾 旭，杨 羚，修文博，邹家齐，凌保东Δ1.成都医学院 结构特异性小分子药物研究四川省高校重点实验室(成都 610500)；2.成都医学院 非编码RNA与药物实验室(成都 610500)；.广州医科大学第一附属医院 检验科(广州 510120)；.成都医学院第一附属医院(成都 610500)

·论 著·

中药单体白花丹醌对替加环素耐药鲍曼不动杆菌的抗菌作用研究*

张 驰1，2，贾 旭1，2，杨 羚3，修文博4，邹家齐1，2，凌保东1，2Δ
1.成都医学院 结构特异性小分子药物研究四川省高校重点实验室(成都 610500)；2.成都医学院 非编码RNA与药物实验室(成都 610500)；3.广州医科大学第一附属医院 检验科(广州 510120)；4.成都医学院第一附属医院(成都 610500)

目的 比较5种中药单体对替加环素耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌作用,探讨替加环素与中药单体联合用药的增敏作用及相关作用机制。方法 采用琼脂二倍稀释法和微量肉汤法，检测鲍曼不动杆菌对14种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。检测中药单体白花丹醌、二氢丹参酮、葫芦素、盐酸小檗碱和紫胡皂苷d对替加环素耐药鲍曼不动杆菌的抑菌作用；用棋盘法测定白花丹醌联合替加环素MIC值，计算部分抑菌浓度指数值(FICI)。选取CCCP、PAβN及白花丹醌作为外排泵抑制剂，观察外排抑制试验结果。结果 临床分离的120株鲍曼不动杆菌对12种抗菌药物均有不同程度耐药，对米诺环素的耐药率相对较低，对多粘菌素B全部敏感，其中，有8株替加环素耐药菌。5种中药单体中白花丹醌对替加环素耐药菌株抑菌活性最佳，MIC值范围是16～32 μg/mL。白花丹醌和替加环素联合试验中，白花丹醌可逆转部分替加环素耐药鲍曼不动杆菌耐药性，75%(6/8)表现为相加作用，25%(2/8)表现为无关作用。外排抑制试验中，CCCP、PAβN及白花丹醌均显示对替加环素有一定的增敏作用。结论 在体外环境下，白花丹醌对替加环素耐药鲍曼不动杆菌具有一定抑菌活性，联合替加环素可降低替加环素耐药鲍曼不动杆菌耐药性，其增加抗菌药物敏感性的作用可能与外排泵抑制有关。

鲍曼不动杆菌；替加环素；白花丹醌

鲍曼不动杆菌已成为院内感染的重要病原菌，可引起各种感染性疾病如肺炎、尿路感染、败血症、脑膜炎及免疫功能低下患者的伤口感染[1]。近年来，多重耐药(multidrug-resistant, MDR )、广泛耐药(extensively-drug resistant,XDR)和全耐药(pan-drug resistant,PDR)的鲍曼不动杆菌不断被分离，其中，仅因感染多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug-resistant A.baumannii,MDRAB)而治疗不当引起的死亡率可达到25%～34%[2]。目前，可选择的有效治疗方案极其有限，因此，在传统感染治疗的基础上，需要探寻新的解决方案。替加环素是一种新型甘氨酰环素类抗菌药物，自2012年初在我国上市以来，就对MDRAB具有良好的抑菌或杀菌作用，临床与其他抗菌药物联合疗法也得到一定认可，被认为是抗感染治疗的最后一道防线。但随着替加环素应用时间延长，鲍曼不动杆菌对替加环素出现不同程度耐药[3]，因此，开发新的抗菌中药和新的用药方案治疗此类感染迫在眉睫。本研究旨在比较5种中药单体对替加环素耐药鲍曼不动杆菌体外抗菌作用，探讨替加环素与中药单体联合用药的增敏作用及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2013年9月至2015年9月成都医学院第一附属医院、广州医科大学第一附属医院非重复鲍曼不动杆菌共120株，均通过法国梅里埃公司VITEK- 2全自动微生物鉴定仪鉴定。质控标准菌株为鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)。

1.2 材料与试剂

环丙沙星、多粘菌素B、四环素、庆大霉素购自上海生工生物工程股份有限公司；盐酸米诺环素、阿米卡星、盐酸左氧氟沙星、头孢哌酮钠、替卡西林、美罗培南、亚胺培南、头孢他定购自大连美仑生物技术有限公司；盐酸多西环素购自北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司；替加环素购自Med Chem Express公司；白花丹醌购自Sigma公司；二氢丹参酮、葫芦素、紫胡皂苷d、盐酸小檗碱购自成都曼思特生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自成都市科龙化工试剂厂；琼脂肉汤培养基(CAMHB)购自海博生物技术有限公司。

1.3 仪器

96孔板(科兹莫生物科技有限公司)、隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)、酶标仪(SpectraMax190,美国MD)、多点接种仪(SAKUMAMIT-P,日本佐久间公司)等。

1.4 方法

1.4.1 14种抗菌药物对120株鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性 采用琼脂二倍稀释法测定鲍曼不动杆菌对14种抗菌药物最低抑菌浓度(minimal inhibition concentration,MIC)，结果参考2015年美国临床和实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute,CLSI)公布标准。

1.4.2 微量肉汤法 1)菌液制备：将细菌接种于LB固体平板上，37 ℃，培养16～20 h，次日挑取3～5个单菌落于0.9%生理盐水中，使用酶标仪600 nm处吸光度(OD)值OD600，调整至麦氏浓度为0.5 (1×108CFU/mL), 并20倍稀释后备用。2)药液制备：替加环素用无菌水溶解，使其浓度为1 280 μg/mL，备用；白花丹醌、二氢丹参酮、葫芦素、盐酸小檗碱、紫胡皂苷d用DMSO溶解，使其浓度为5 120 μg/mL，备用。不同浓度抗菌药物配制:将替加环素和白花丹醌用肉汤培养基倍比稀释，使其浓度分别为640 μg/mL 、320 μg/mL、…、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL待用；2 560 μg/mL、1 280 μg/mL、…、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL待用。现用现配。3)单药MIC值的测定：将CAMHB 180 μL培养基加入96孔板，再取配制好的不同浓度的单药稀释液，依次由低浓度到高浓度加入培养基中，每孔加入10 μL。取制备好的菌液10 μL，分别加入已加药的孔中，使最终接种菌量约5×105CFU/mL。另设无菌对照孔(孔内加CAMHB 200 μL)和无药对照孔(孔内加CAMHB 190 μL和菌液10 μL)，振荡混匀后，37 ℃恒温培养箱孵育16～20 h，肉眼观察结果[4]。 4)棋盘稀释法(白花丹醌联合替加环素)：根据单药测定的MIC值，确定8个稀释梯度。将CAMHB 170 μL培养基加入96孔板，再将配好的不同浓度的单独药物稀释液，从 MIC值4倍开始，按棋盘法设计两两组合，各取10 μL，依次由低浓度到高浓度加入培养基中。再取制备好的菌液10 μL分别加入已加药的孔中，另设无菌对照孔和无药对照孔，振荡混匀后，37 ℃恒温培养箱孵育16～20 h，肉眼观察结果，计算抑菌浓度指数。

1.4.3 结果判断 替加环素的MIC值参考欧洲药敏试验委员会(European committee on antimicrobial susceptibility testing ,EUCAST)标准[5](>2 μg/mL 为耐药；≤1 μg/mL为敏感)；部分抑菌浓度指数值(FICI)[6]=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用；FICI≤0.5为协同作用，0.5

1.5 外排泵抑制实验

1.5.1 工作浓度的确定 取羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)、苯丙氨酸-精氨酸-β-苯胺(PAβN)和白花丹醌溶解后，配制成梯度浓度的药液，加入到CAMHB中，方法如单药MIC值的测定。CCCP终浓度为40、20、10、5、2.5 μg/mL；PAβN终浓度为100、50、25、12.5、7.5 μg/mL；白花丹醌为16、14、12、8 μg/mL。

1.5.2 外排泵抑制试验 确定CCCP和PAβN工作浓度为5 μg/mL和50 μg/mL，白花丹醌工作浓度为12 μg/mL。检测加入CCCP、PAβN、白花丹醌前后，菌株对替加环素MIC值的变化情况，按照上述方法采用肉汤稀释法筛选。应用泵抑制剂后，MIC值降低至使用泵抑制剂前的1/4或者更低的，判定为主动外排阳性[7]。

2 结果

2.1 14种抗菌药物对120株鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性

120株鲍曼不动杆菌中替加环素的耐药率为6.7%(8/120)，对12种抗菌药物均有不同程度耐药，其中，对碳青霉烯类、氨基糖胺类及喹诺酮类的耐药率均高于60.0%，对米诺环素的耐药率相对较低，对多粘菌素B全部敏感(表1)。

表1 14种抗菌药物对120株鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性[n(%)]

2.2 5种中药对替加环素耐药株(tigecycline-resistant A.baumannii,TRAB)的抑菌作用

中药单体葫芦素、盐酸小檗碱、柴胡皂苷d对TRAB 的MIC值均>128 μg/mL，二氢丹参酮对Ab35的MIC值为64 μg/mL；白花丹醌对TRAB 的MIC值范围为16～32 μg/mL，与其他4种中药单体比较，白花丹醌具有较好的抑菌活性(表2)。

表2 5种中药单体对TRAB的抑菌作用(n=8，μg/mL)

2.3 白花丹醌与替加环素体外联合抑菌作用

联合用药时，TRAB的MIC值比单独用药时MIC值所减小，白花丹醌的MIC值由16～32 μg/mL，减小到8～32 μg/mL；替加环素的MIC值由4～8 μg/mL，减小到0.5～4 μg/mL。经棋盘法检测计算 FICI，其中75%具有相加作用；25%为无关作用(表3)。

表3 白花丹醌与替加环素联合对TRAB的抑菌作用(n=8)

2.4 外排泵抑制实验

8株TRAB加入外排泵抑制剂CCCP(5 μg/mL)、PAβN(50 μg/mL)及白花丹醌(12 μg/mL)后，外排阳性率分别为50.0%(4/8)、37.5%(3/8)、50.0%(4/8)(表4)。

表4 加入CCCP、PAβN、白花丹醌前后替加环素对TRAB的MIC值比较(n=8，μg/mL)

菌株号替加环素替加环素+CCCP替加环素+PAβN替加环素+白花丹醌AbT24422AbT38422AbT480.50.252AbT54421AbT640.522Ab354221Ab374114Ab8540.2544

3 讨论

替加环素对MDRAB具有良好的抗菌作用，但由于替加环素在体内组织分布较血药浓度低，单独用于MDRAB感染治疗时，易诱导产生耐药性，故临床治疗常需联合应用其他抗菌药物以提高治愈率[8]。体外研究[9]证明，采用替加环素为基础的联合用药，可以提高对耐药性鲍曼不动杆菌的抗菌作用。本研究分析120株临床分离鲍曼不动杆菌对14种抗菌药物的敏感性，其中有8株替加环素耐药菌，耐药率为6.7%。120株临床分离菌对碳青霉烯类、氨基糖胺类及喹诺酮类的耐药率均高于60.0%，耐药情况较为严重。早在上个世纪,我国学者就证明了传统中草药对细菌的抑制作用，因此，本研究比较了5种中药单体对TRAB体外抑菌活性，发现白花丹醌对TRAB具有较强的抗菌效果，MIC值范围是16～32 μg/mL。

中药白花丹醌是草药白花丹的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌等作用。临床曾用于治疗痤疮及痈疮，还具有降血压、抗凝血、抗生育及祛痰等生物活性。白花丹醌对革兰阳性菌如葡萄球菌、脑膜炎双球菌、肺炎双球菌有抑制作用，并有抗衣原体和病毒作用[10-11]。多项研究[8, 12]表明，某些中药与抗菌药物联用可以产生明显的增效作用，因此，中药与抗菌药物联合用药成为解决耐药的新方案。本研究将替加环素联合白花丹醌，观察到TRAB对替加环素的敏感性明显增加，75%表现为相加作用，25%表现为无关作用，并未发现拮抗作用。国内外研究[6, 13-14]表明，替加环素与抗菌药物(除阿米卡星)联合后，协同率不高，且多表现为无关作用。将白花丹醌与外排泵抑制剂CCCP、PAβN相比较，发现白花丹醌与CCCP的外排阳性率相同，二者均高于PAβN。一些研究[15- 16]已经证明，RND-型转运蛋白和外排泵的过度表达可导致鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药。本研究所选取的外排抑制剂中，PAβN作为一种广谱的外排抑制剂，对多数革兰氏阴性菌有明显作用；CCCP是抑制质子转运的强解偶联剂，破坏质子跨膜电化学梯度，使药物在细菌体内的蓄积量增加，从而提高细菌对药物的敏感性[17]。 Shukla等[18]发现，白花丹醌可以特异性抑制多药耐药性结合盒(ABC)转运蛋白的外排作用，使得菌体内的药物外排减少，抗菌药物蓄积，从而达到抑菌或杀菌作用。因此，本研究中，白花丹醌联合替加环素表现为相加作用，可能与外排泵抑制有关。这与李娟[10]等研究白花丹醌可逆转鲍曼不动杆菌的耐药性结论相符合。

综上所述，白花丹醌与替加环素联合用药可增加TRAB对替加环素的敏感性，且部分具有相加作用，其抗菌增敏机制可能与外排泵抑制相关。因此，抗菌药物联用某些中药单体抗耐药性的研究具有良好的前景。

[1]Poirel L, Nordmann P. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology[J]. Clin Microbiol Infect, 2006,12(9):826-836.

[2]Song J Y, Cheong H J, Noh J Y,etal. In vitro Comparison of Anti-Biofilm Effects against Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii: Imipenem, Colistin, Tigecycline, Rifampicin and Combinations[J]. Infect Chemother, 2015,47(1):27-32.

[3]Tao C, Kang M, Chen Z,etal. Microbiologic study of the pathogens isolated from wound culture among Wenchuan earthquake survivors[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2009,63(3):268-270.

[4]邓梅. 多重耐药鲍曼不动杆菌对替加环素耐药机制及同源性研究[D].杭州：浙江大学, 2014:1-70.

[5]Kahlmeter G, Brown D F, Goldstein F W,etal. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) Technical Notes on antimicrobial susceptibility testing[J]. Clin Microbiol Infect, 2006,12(6):501-503.

[6]Dong X, Chen F, Zhang Y,etal. In vitro activities of sitafloxacin tested alone and in combination with rifampin,

colistin, sulbactam, and tigecycline against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(5):8135-8140.

[7]周云，凌保东. 4种外排泵抑制剂对鲍曼不动杆菌耐药性的抑制影响[J]. 中国抗生素杂志, 2013，38(6):461-466.

[8]谭俊青，李蔼文，王康椿，等. 头孢哌酮-舒巴坦联合中药对泛耐药鲍曼不动杆菌抗菌活性的研究[J]. 检验医学, 2016,31(5):350-354.

[9]Chuang Y C, Cheng C Y, Sheng W H,etal. Effectiveness of tigecycline-based versus colistin- based therapy for treatment of pneumonia caused by multidrug-resistant Acinetobacter baumannii in a critical setting: a matched cohort analysis[J]. BMC Infect Dis, 2014,14:102.

[10] 李娟，李小宁，钟正灵，等. 中药单体白花丹醌对鲍曼不动杆菌的耐药逆转作用[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2015，20(2):155-159.

[11] Padhye S, Dandawate P, Yusufi M,etal. Perspectives on medicinal properties of plumbagin and its analogs[J]. Med Res Rev, 2012,32(6):1131-1158.

[12] 曹翠萍，宁海强，位朋，等. 中药与抗菌药物联用对大肠杆菌抑制作用的研究[J]. 西南农业学报, 2008，21(1):217-219.

[13] Ozbek B, Otuk G. In vitro activities of tigecycline alone and in combination with colistin sulfate or sulbactam against carbapenem-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii strains isolated from Intensive Care Units[J]. Int J Antimicrob Agents, 2010,36(2):191-192.

[14] 史金英，宋宁，柴书坤，等. 替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦治疗泛耐药鲍氏不动杆菌的临床研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2015，25(8):1750-1752.

[15] Ruzin A, Immermann F W, Bradford P A. RT-PCR and statistical analyses of adeABC expression in clinical isolates of Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex[J]. Microb Drug Resist, 2010,16(2):87-89.

[16] Sun J R, Chan M C, Chang T Y,etal. Overexpression of the adeB gene in clinical isolates of tigecycline-nonsusceptible Acinetobacter baumannii without insertion mutations in adeRS[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010,54(11):4934-4938.

[17] 周云，凌保东. 鲍曼不动杆菌抗生素主动外排泵转运系统与外排泵抑制剂[J]. 中国抗生素杂志, 2012，37(5):321-328.

[18] Shukla S, Wu C P, Nandigama K,etal. The naphthoquinones, vitamin K3 and its structural analogue plumbagin, are substrates of the multidrug resistance linked ATP binding cassette drug transporter ABCG2[J]. Mol Cancer Ther, 2007,6(12 Pt 1):3279-3286.

A Study on the Antibacterial Effect of Chinese Medicine Plumbagin on Tigecycline-Resistant Acinetobacter Baumannii

ZhangChi1,2,JiaXu1,2,YangLing3,XiuWenbo4,ZouJiaqi1,2,LingBaodong1,2*.

1.SmallMoleculeDrugsSichuanKeyLaboratory,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.Non-codingRNAandDrugDiscoveryLaboratory,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 3.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China; 4.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To investigate the in vitro antibacterial effect of five Traditional Chinese Medicine (TCM) monomers on tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii and explore the bacterial sensitizing enhancement effect of tigecycline in combination with these monomers and the related mechanism. Methods Minimum inhibitory concentration (MIC) of 14 antimicrobial agents for 120 clinical isolates of A.baumannii was measured by the methods of agar dilution and broth microdilution. The antibacterial activity of the TCM monomers including plumbagin, dihyd rotanshinone, cucurbitacin, berberine hydrochloride and saikosaponin-d against tigecycline-resistant A.baumannii was investigated. The MIC value of plumbagin combined with tigecycline was determined by the chessboard method and the fractional inhibitory concentration (FIC) index was further calculated. The efflux pump inhibitors involving CCCP, PAβN and plumbagin were used to evaluate the bacterial efflux inhibition effect. Results The resistance to 12 antimicrobial agents was found in all the 120 clinical isolates to different degrees, ranging from the relatively low resistance of minocycline to the complete sensitivity of polymyxin B. Among them, eight tigecycline-resistant isolates were identified. Plumbagin displayed the best antibacterial activity in the five TCM monomers with the MIC value of 16～32μg/ml. Plumbagin could reverse the partial resistance of tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii as demonstrated by plumbagin-tigecycline combination, which showed 75% (6/8) additive effect and 25% (2/8) irrelevant effect. In the efflux inhibition test, CCCP, PAβN and plumbagin all showed certain degree of sensitizing enhancement effect to tigecycline. Conclusion The in vitro plumbagin has a certain antibacterial activity against tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii; the plumbagin-tigecycline combination can reduce the resistance of tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii; the sensitization effect of plumbagin may be related with the efflux pump inhibition.

Acinetobacter baumannii; Tigecycline; Plumbagin

*通信作者：国家自然科学基金面上项目(No:81373454)；四川省科技厅应用基础项目(No:2013Jy0065)

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170321.0924.022.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.02.001

R285.5

A

△通信作者：凌保东，E-mail: lingbaodong@cmc.edu.cn