茎瘤芥(榨菜)抽薹性状相关SSR分子标记的筛选

［KH－*3D］沈进娟，杨仕伟，刘雪姣，冉广葵，于晓虎，曾胜，张召荣，朱学栋

(重庆市渝东南农业科学院，重庆涪陵408099)

茎瘤芥(榨菜)抽薹性状相关SSR分子标记的筛选

［KH－*3D］沈进娟，杨仕伟，刘雪姣，冉广葵，于晓虎，曾胜，张召荣，朱学栋

(重庆市渝东南农业科学院，重庆涪陵408099)

茎瘤芥先期抽薹给榨菜产量带来极大损失，是当前影响榨菜产业快速健康发展的主要因素之一。本研究采用茎瘤芥极早抽薹材料‘92’和极晚抽薹材料‘203’配制杂交组合，自交获得F2代群体，根据集团分离分析法，运用600对芸薹属SSR共有引物，进行茎瘤芥抽薹性状基因连锁的分子标记筛选。最终得到1个SSR标记Ol12-D09在早抽薹基因池中扩增出特征条带，而晚抽薹基因池中无特征条带，经F2代单株验证发现与茎瘤芥早抽薹基因紧密连锁，根据Kosambi函数估算其连锁距离为10．9 cM。本研究结果筛选的SSR标记可用于茎瘤芥先期抽薹的分子标记辅助育种，并为茎瘤芥耐抽薹品种的选育提供理论依据。

茎瘤芥;抽薹;集团分离分析法;SSR标记

茎瘤芥(Brassica juncea var．tumida Tsen＆Lee)又称榨菜，俗称青菜头，是十字花科芸薹属芥菜(B．juncea juncea Coss．)种的一个变种。榨菜是我国长江流域特别是重庆市的特产蔬菜之一。大面积生产上推广的榨菜品种熟性较为集中，一般9月中旬播种，次年2月上中旬收获，若遇“暖冬”，“先期抽薹”现象则较为严重。近年来，“涪陵青菜头”以“早”或“晚”的季节差，作为时鲜蔬菜销售，既提高了产品附加值，又增加了菜农收入，但现有品种不能满足生产上的早播早收或晚播晚收，否则极易出现先期抽薹或产量不高，空心严重，菜形较差，这也是鲜销青菜头生产大规模开展的技术“瓶颈”。植株抽薹后蔬菜失去了使用价值，大大降低了经济效益，是当前影响重庆市榨菜产业快速健康发展的主要因素之一，也是新区特别是中高海拔地区引种栽培成功的关键因素。

晚抽薹育种一直是十字花科作物的一个重要的育种目标［1］。大白菜［2－3］、甘蓝［4－6］、和萝卜［7－8］等十字花科蔬菜进行抽薹性状的分子标记筛选、基因定位和辅助育种等研究比较领先，这些研究加快了耐抽薹性育种进程，降低了产量损失。而茎瘤芥先期抽薹研究起步较晚，主要通过栽培技术控制和减少先期抽薹的发生，受环境影响较大，损失无法预测。目前茎瘤芥研究主要集中在新品种选育［9－10］、栽培技术研究［11－13］和加工品质［14］等方面的研究，对分子标记辅助育种鲜有报道，对耐抽薹品种的鉴定和选育比较滞后，引种也带来较大难度，严重影响了茎瘤芥新品种的大面积推广和应用。

因此深入开展茎瘤芥抽薹性状相关SSR标记研究，筛选茎瘤芥耐抽薹性品种迫在眉睫，而有关茎瘤芥抽薹基因的SSR标记研究在国内尚未见报道。本研究以茎瘤芥极早抽薹自交系、极晚抽薹自交系以及杂交后代为实验材料，采用BSA方法和SSR技术筛选与茎瘤芥早抽薹基因紧密连锁的标记，以期实现榨菜抽薹性状的分子标记辅助育种。对茎瘤芥耐抽薹性状的分子遗传改良具有重要的理论和实践意义。

1 材料与方法

1．1 材料

以不同熟性茎瘤芥栽培种自交系作为亲本，其中极早抽薹品种P1:92;极晚抽薹品种P2:203。P1×P2得到F1，F1经自交获得F2，以上材料均由重庆市渝东南农业科学院提供。试验地选择肥力均匀一致，地势平坦，植株生长条件均严格要求一致。

1．2 方法

1．2．1 材料处理田间观察F2代材料抽薹性状，记录出现较早和较晚抽薹单株;其中，早抽薹亲本和F2群体中出现1株抽薹植株时开始记载抽薹日期，以后每隔1 d记载1次数据，直到所有群体抽薹完毕为止，调查标准以花茎伸长5 cm为抽薹开始的标志。用BSA法将目前已经获得的F2分离群体根据表型分成2组，一组表现目标基因的性状(早抽薹)的群体，另一组不表现目标基因的性状(晚抽薹)的群体，从每一组中各随机选取构成两极端DNA池的植株个体，形成2个类似近等基因系遗传组成的对比DNA库，即早抽薹池和晚抽薹池。

采用CTAB法提取叶片中的基因组DNA，并利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙淀显色进行定量。利用合成的600对引物结合银染方法对两亲本的扩增条带进行比较，筛选在两亲本有多态性的引物，然后用在两亲本间有多态性的引物对基因池的扩增条带进行比较，筛选在两亲本间和两基因池间有相同多态性的引物。

1．2．2 SSR分析试验所用SSR引物由上海英俊生物公司合成，分子标记所用试剂及DNA Marker由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。经PCR反应条件和反应程序优化［15］，PCR反应体系为15 μl:1×缓冲液，2．5 μmol/L MgCl2、150 μmol/L dNTP、1 U DNA聚合酶和100 ng DNA模板，所述的引物含量为0．2 μmol/L。PCR反应程序为:95℃预变性5 min，1个循环;95℃预变性40 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，每个循环降1℃，共11个循环;95℃预变性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30个循环，72℃再延伸5 min;4℃低温保存。

扩增产物在10%的的变性聚丙烯酞胺凝胶300 V电压，200 mA电流，进行电泳70～120 min。电泳后放入200 mL含20 mL乙醇、10 mL乙酸的固定液，50 r/min振荡固定12～15 min;然后用ddH2O洗1次，放入200 mL 0．2%AgNO3溶液中银染12～15 min;用ddH2O洗2次，倒入200 mL(1．5% NaOH+0．4%甲醛)ddH2O中显色5～8 min，显色后可进行拍照。

2 结果与分析

2．1 多态性引物的筛选

根据芸薹作物网(http://www．brassica．info)公布的十字花科共同引物合成600对引物。结合银染方法对两亲本的扩增条带进行比较分析，筛选出63对在两亲本间有多态性的引物，多态率为10．5%。然后用在两亲本间有多态性的引物对早抽薹基因池和晚抽薹基因池的扩增条带进行进一步筛选，筛选出同时在两亲本间和两基因池间有相同多态性的引物。

2．2 抽薹性状的调查

2014年9 月20日同时播种亲本P1、P2、F1和F2代抽薹群体，植株定值于重庆市渝东南农业科学院试验地，每隔1 d调查抽薹植株。将植株从定植到抽薹时间为149～160 d左右视为早抽薹植株，将定植到抽薹开花时间为171～182 d左右视为晚抽薹，其余的为中间型。调查F2单株110株，其中表现早抽薹的单株34株，表现晚抽薹单株22株，中间性状单株54株。

2．3 连锁SSR标记的筛选

以茎瘤芥早抽薹材料‘92’和晚抽薹材料‘203＇为亲本，将F2代群体根据BSA法建立茎瘤芥早抽薹基因池和晚抽薹基因池，分别随机选取早抽薹群体和晚抽薹群体的F2代单株各5株，提取DNA后等量混合，组成早抽薹基因池和晚抽薹基因池，用于引物筛选。采用63对有多态性的SSR引物，以构建的两个基因池为模板进行PCR扩增，PCR产物用10%的聚丙烯酞胺凝胶电泳进行检测，筛选到1个在亲本及早抽薹基因池和晚抽薹基因池间均存在明显差异的SSR标记(图1)，在早抽薹基因池中有特征条带，而在晚抽薹基因池中没有特征条带，该引物编号是Ol12-D09，引物序列为正义链序列: CGAGCTGAAGTGGATATTCG，反义链序列ACTCGCTTTTACCGTCGTC，预测其可能与抽薹性状存在连锁关系。

图1 SSR引物Ol12-D09在亲本和抽薹池中的扩增Fig．1Profile of the differentially amplified products from parent materials and the bolting gene pools with SSR marker Ol12-D09

2．4 连锁SSR标记的验证

对上述在早抽薹基因池和晚抽薹基因池中筛选到的可能与抽薹性状连锁的SSR标记进行双亲验证(图1)，结果表明，SSR标记Ol12-D09扩增的特征条带出现在早抽薹亲本材料‘92’中，而亲本晚抽薹材料‘203’中没有，这与基因池之间的差异一致。同时用SSR Ol12-D09标记进行F2代单株验证，结果显示，在早抽薹群体中，34株早抽薹单株中有32株存在特征带(图2)，而在22株晚抽薹单株中有4株存在特征带(图3)，说明该标记与抽薹性状存在连锁关系。

2．5 连锁标记与目标性状遗传距离估算

针对与抽薹性状存在一定连锁关系的SSR标记Ol12-D09，在本研究的F2代群体中，发生重组的个体数为2+4=6，F2代群体共有56个单株，所以该标记的重组率为6/56=10．7%。根据Kosambi函数(m=251n［(1+2r)/(1－2r)］，m为遗传距离，r为重组率)［2］，上述筛选获得的SSR Ol12-D09标记与早抽薹性状相关基因的遗传连锁距离为10．9 cM。

图2 SSR引物Ol12-D09对早抽薹基因池中F2代单株基因组DNA的验证Fig．2Profile of the amplified products from genomic DNAs of individual plant in F2of early bolting gene pools with SSR marker Ol12-D09

图3 SSR引物Ol12-D09对晚抽薹基因池中F2代单株基因组DNA的验证Fig．3Profile of the amplified products from genomic DNAs of individual plant in F2of late bolting gene pools with SSR marker Ol12-D09

3 讨论

近年来，由于分子标记辅助育种技术自身的优点，不受环境影响，不受时间限制，鉴定结果准确可靠等，已广泛应用于十字花科蔬菜育种和种质资源材料的鉴定。目前常用的DNA分子标记有SSR［2－3］、AFLP［7－8］、RAPD［4，16］、SCAR［4，7］和ISSR［16－18］等标记，根据选择材料的差异可以选择不同的分子标记，可单独使用，也可联合使用。其中，SSR分子标记本身具有呈孟德尔式遗传，共显性;多态性丰富，稳定性好，重复性高，检测技术简便快捷，实验成本低;对DNA数量及纯度要求不高;引物序列公开发表，易于传播使用等优点［17］。本研究应用SSR进行茎瘤芥抽薹性状分子标记的筛选，成功筛选到1条与茎瘤芥早抽薹紧密连锁的分子标记，可用于分子标记辅助育种。张波等［16］研究了与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁的RAPD、SSR、ISSR、SRAP分子标记，最终仅在SSR引物中筛选到一条引物DBC 16在晚抽薹池中扩增出多态性片段LB，与晚抽薹基因紧密连锁，其遗传距离为5．7 cM;而其他的四种分子标记均没有找到与晚抽薹基因紧密连锁的分子标记。周贤达等［17］研究结果表明芥菜抽薹符合1∶2∶1的遗传规律，推测芥菜抽薹可能受一个主效基因的控制，应用ISSR标记早抽薹池中筛选到1条引物UBC826，遗传距离为4．0 cM。芥菜种类多分布广，不同的芥菜种间差异较大，同一引物也不能适应所有物种，因此，急需筛选出适合茎瘤芥的特异性强的分子标记辅助田间耐抽薹育种。

大量研究结果表明，不同的作物筛选的分子标记不同。有的筛选的分子标记与晚抽薹基因连锁，徐文玲等［7］运用AFLP分子标记技术，对萝卜抽薹基因相连锁的AFLP分子标记进行研究获得两个与萝卜耐抽薹基因相连锁的AFLP标记，遗传距离分别为14．6和9．1 cM，并将其中一个标记转化为简单易行的SCAR标记，遗传距离为7．5 cM，可以用于萝卜育种的分子标记辅助育种。有的筛选的分子标记与早抽薹基因连锁，这与本研究结果一致，饶立兵等［2］根据集团分离分析法，进行大白菜晚抽薹性状基因相连锁的分子标记研究，得到了1个SSR标记‘BRMS-026’与大白菜早抽薹基因紧密连锁，连锁距离为7．2 cM，可用于辅助选育大白菜耐抽薹品种。冒维维等［18］应用ISSR和SRAP标记进行了菜薹抽薹性分子标记筛选及定位研究，筛选到四个引物均与早抽薹基因相连锁，且标记E13M4最近，遗传距离为16．8 cM，这为菜薹抽薹基因的定位和分子标记辅助育种奠定了初步基础。无论是与早抽薹基因连锁还是与晚抽薹基因连锁，均能把不同抽薹性状的材料较好地分离开，为分子标记辅助育种奠定了基础。

目前利用其他的遗传连锁标记转化成连锁更紧密的分子标记，应用于分子标记辅助育种也有较多报道。其中关于SCAR转化成功的例子也不少。乌兰等［4］以与结球甘蓝迟抽薹基因连锁的N 1750为引物，应用RAPD技术进行PCR扩增，检测到迟抽薹基因，对特异片段进行回收、克隆和测序，依据测序结果设计SCAR引物，经验证与甘蓝迟抽蔓基因连锁的RAPD标记被成功转化为SCAR标记，为甘蓝分子标记辅助选择育种提供了基础。本研究获得的紧密连锁分子标记，可以将差异片段进行回收、克隆、测序，设计SCAR引物，有望获得遗传距离小于5．0 cM的分子标记，为进一步的基因定位提供参考依据。

4 结论

目前茎瘤芥耐抽薹育种采用传统方法，工作量大，周期长，而寻找与抽薹紧密连锁的DNA分子标记可以有效减轻传统育种手段的工作强度，同时也为抽薹基因的图位克隆奠定下良好的基础。芥菜抽薹性状一般认为主要受一个主效基因的控制［17］，因此使用SSR标记可以寻找到有效的连锁基因。集团分离分析法，只需要一次杂交，一次自交便可获得有效的分离群体，相比于近等基因系法需要回交7次以上，省时省力又效率高。但是集团分离分析法对亲本要求比较严格，本研究选用的极端抽薹的两个自交系，抽薹性状可以稳定遗传，而其他性状遗传背景相近，防止了不必要的干扰。本研究通过集团分离分析法获得的与茎瘤芥早抽薹紧密连锁的SSR标记遗传距离为10．9 cM，可以用于茎瘤芥育种的分子标记辅助育种。

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(责任编辑 李洁)

Selection of SSR Molecular Markers of Bolting in Tumorous Stem Mustard

SHEN Jin-juan，YANG Shi-wei，LIU Xue-jiao，RAN Guang-kui，YU Xiao-hu，ZENG Sheng，ZHANG Zhao-rong，ZHU Xue-dong
(Chongqing Yudongnan Academy of Agricultural Sciences，Chongqing Fuling 408099，China)

The early bolting of tumorous stem mustard caused tremendous loss to mustard production，which became one of the major factors hampering the rapid and healthy development of the mustard industry．In the present study，bulked segregant analysis(BSA)was used to identify the SSR markers related to bolting genes in the F2generation of an early bolting cultivar‘92’and a late bolting cultivar‘203’of tumorous stem mustard．600 pairs of Brassica genus SSR primers were used to identify the polymorphism，and one SSR marker Ol12-D09 was found in the early bolting gene pool，with a close genetic distance of 10．9 cM calculated by the kosambi function．The SSR marker identified in the present study can be used for molecular marker-assisted breeding in the early bolting of tuber mustard．The findings can also provide theoretical foundations for the breeding of bolting-resistant tuber mustard．

Tumorous stem mustard;Bolting;Bulked segregant analysis(BSA);SSR marker

S639．9

A

1001－4829(2017)1－0188－05

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．032

2016－02－28

重庆市基础科学与前沿技术研究(一般)项目(cstc2013jcyjA80028);重庆市应用开发(一般)项目(cstc2013yykfA80011);重庆市社会事业与民生保障科技创新专项项目(cstc2015shms-ztzx80005)

沈进娟(1980－)，女，山东日照人，硕士，副研究员，从事芥菜(榨菜)遗传育种与生物技术研究，E-mail:jinjuanshen @126．com。