高效液相色谱法测定柴胡配方颗粒中柴胡皂苷a含量

缪希红，李晓燕，高君文，苏平菊

（1．河北省承德市中心医院，河北 承德 067000； 2．河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035）

·检验检测·

高效液相色谱法测定柴胡配方颗粒中柴胡皂苷a含量

缪希红1，李晓燕2，高君文2，苏平菊2

（1．河北省承德市中心医院，河北 承德 067000； 2．河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035）

目的建立测定柴胡配方颗粒中柴胡皂苷a含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法色谱柱采用Welch Ultimate XB-C18柱（250mm× 4．6mm，5 m），以乙腈-甲醇-0．1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为210 nm。结果柴胡皂苷a进样量在0．660 4～6．604 0 g范围内与峰面积线性关系良好，回归方程为 Y＝288．216X-6．057，r＝0．999 97，柴胡皂苷a的平均回收率为101．99%，RSD为1．91%（n＝9）。结论该方法简便、准确，重复性好，可用于柴胡配方颗粒的质量控制。

高效液相色谱法；柴胡配方颗粒；柴胡皂苷a

柴胡配方颗粒是由中药材柴胡经提取、浓缩、分离、干燥、制粒及包装等加工工艺制成的颗粒剂，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气的功效[1]，用于和解退热、疏肝解郁、升举阳气、升散除湿等[2]。服用方便，剂量准确，高效迅速，质量稳定，近年来，其销量逐年上升，深得消费者青睐[3]。柴胡配方颗粒中的主要药味柴胡为历版《中国药典》收载药材，应用广泛，其主要化学成分为三萜皂苷类成分，包括柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b3、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d等[4-5]，均有很强的药理活性，其中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量较高，是柴胡重要的质量评价指标[6-8]。为了更好地控制柴胡配方颗粒的质量，本研究中采用高效液相色谱(HPLC)法对柴胡皂苷a进行了含量测定，现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Agilent1100型高效液相色谱仪，包括VWD紫外检测器（美国安捷伦公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AT201型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1．2 试药

柴胡皂苷a对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110777-200406）；柴胡配方颗粒（石家庄以岭药业股份有限公司，批号为150101）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：WelchUltimateXB-C18柱(250mm×4．6mm，5μm)；流动相：乙腈为流动相 A，甲醇为流动相 B，0．1%磷酸溶液为流动相C，梯度洗脱，见表1；流速：1 mL／min；柱温：26℃；检测波长：210 nm。理论板数按柴胡皂苷a峰计算应不低于5 000。

表1 流动相梯度洗脱程序

2．2 溶液制备

对照品溶液：取柴胡皂苷a对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含柴胡皂苷a0．2mg的溶液，即得。

供试品溶液：取本品，研细，取1．0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25m L，密塞，称定质量，超声处理（功率250W，频率40 kHz）20min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：因本制剂为单味药材且制剂时未添加辅料，取制备供试品溶液用的甲醇。

2．3 方法学考察

阴性干扰试验：取2．2项下3种溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液相应位置上有相同保留时间色谱峰，阴性对照无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取质量浓度为 0．066 04，0．132 08，0．198 12，0．330 2，0．660 4 g／L的柴胡皂苷a对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积积分值(Y)为纵坐标、进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝288．216X-6．057，r＝0．999 97。结果表明，柴胡皂苷a进样量在0．660 4～6．604 0μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：精密吸取对照品溶液10μL，在拟订色谱条件下连续进样5次，测定峰面积。结果对照品的平均峰面积为569．391，RSD为0．69%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液 10μL，分别于 0，2，4，6，8，10，12，24 h时进样，测定峰面积。结果的 RSD为1．82%（n＝8），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品9份，分别取高、中、低3个剂量，依法制备供试品溶液，测定含量。结果见表2。

表2 柴胡皂苷a重复性试验结果（n＝9）

加样回收试验：取同一批样品9份，分为3组，分别精密加入25m L高、中、低3种质量不同浓度的柴胡皂苷a对照品溶液，进行超声提取，测定含量，计算回收率。结果见表3。

表3 柴胡皂苷a加样回收试验结果（n＝9）

耐用性试验：取同一批样品，分别在不同测定波长、不同柱温及不同色谱条件下检测柴胡皂苷a的含量。结果在210，208，212 nm波长下，柴胡皂苷 a的 RSD为1．70%(n＝3)；在24，26，28，30℃柱温下，柴胡皂苷a的 RSD为1．54%(n＝4)；3种不同色谱柱对样品的分离无影响，柴胡皂苷a的 RSD为1．68%(n＝3)。可见，测定条件的微小变动对检测结果无影响。

2．4 样品含量测定

用所建立的含量测定方法，测定3批柴胡配方颗粒柴胡皂苷a的含量，结果批号为150101，150102，150103的3批样品中柴胡皂苷a的含量分别为4．6641，3．7038，3．708 8mg／g。

3 讨论

3．1 色谱条件选择

柴胡中的主要成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d在紫外区仅有末端吸收，该区域成分较多，不易进行定量测定，检测时易受到试剂的干扰[9]。另外，皂苷类成分样品处理较复杂，故对其定量测定不多。目前，柴胡制剂中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的测定方法主要为HPLC法，检测器有ELSD检测器和VWD紫外检测器[10-14]，流动相为甲醇-乙腈-水 (25∶45∶30)、乙腈-水(28∶72)及乙腈-水进行梯度洗脱。本研究中曾采用2010年版《中国药典（一部）》柴胡项下含量测定的流动相[1]，对乙腈-水进行梯度洗脱，但该流动相柴胡皂苷a分离不好，且峰形不对称，经反复调整流动相比例，并在流动相中添加甲醇和磷酸，使柴胡皂苷a获得良好分离，峰形对称，基线平稳，梯度洗脱可缩短分析时间，降低检测成本。

3．2 样品处理筛选

柴胡皂苷测定的样品处理方法有采用甲醇超声提取，大孔吸附树脂除杂[10]，采用5%浓氨试液的甲醇溶液提取后用正丁醇萃取的方法[11-13]，以及采用甲醇提取、正丁醇萃取、碱洗的处理方法[13]等，但处理过程烦琐，操作复杂，不利于大批量生产的产品控制。本研究中采用甲醇超声提取，取续滤液即可，方法简单，易操作，特别适用于大批量生产的产品质量控制。

3．3 提取溶剂选择

本研究曾对70%甲醇、甲醇及含5%浓氨试液的甲醇溶液提取的样品进行柴胡皂苷a检测，结果3种溶剂测定的柴胡皂苷a含量差异不明显，色谱峰也无差异，为简化操作，选择用甲醇做提取溶剂；为保证柴胡皂苷a提取充分，对提取溶剂用量及超声处理时间进行考察，结果提取溶剂选择25m L与50m L时柴胡皂苷a含量无差异，超声处理时间20～40 min对柴胡皂苷a含量影响不大。

3．4 不足

柴胡在煎煮过程中皂苷类成分存在结构性转变[15-16]，柴胡配方颗粒中柴胡在提取过程中成分发生变化，导致柴胡皂苷d的含量过低，无法进行定量测定，因此本研究中仅对柴胡皂苷a进行了含量测定。

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Content Determ ination of Saikosaponin A in Chaihu Dispensing G ranules by HPLC

Miao Xihong1,Li Xiaoyan2,Gao Junwen2,Su Pingju2
(1．Chengde Central Hospital,Chengde,Hebei,China 067000; 2．Hebei Yiling Medicine Institute,Shijiazhuang,Hebei,China 050035)

Ob jective To establish an HPLC method for the content determination of saikosaponin a in Chaihu Dispensing Granules．M ethods HPLC analysis was performed on an Welch Ultimate XB-C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm)with acetonitrilemethanol-0．1% phosphoric acid solution as mobile phase for gradient elution．The detection wavelength was at 210 nm．Results The calibration curve of saikosaponin a showed a good linearity within the range of 0．660 4-6．604 0μg,and the regression equation was Y＝288．216 X-6．057(r＝0．999 97)．The average recovery was 101．99% and RSD was 1．91%(n＝9)．Conclusion The method is convenient,accurate and reproducible to operate and is suitable for the quality control of Chaihu Dispensing Granules．

HPLC;Chaihu Dispensing Granules;saikosaponin a

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2017)03-0033-03

2016-06-22；

2016-10-20)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．011

缪希红（1974-），女，满族，副主任中医师，研究方向为中医临床及制剂开发，（电子信箱）944359932＠qq．com。

李晓燕（1974-），女，满族，正高级工程师，研究方向为中药新药开发及质量标准，（电话）0311-66703013（电子信箱）sjzyllxy＠163．com。