水飞蓟宾对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织保护作用的研究*

曹旭丹任春梅 和田田 刘 健

（河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001）

·研究报告·

水飞蓟宾对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织保护作用的研究*

曹旭丹△任春梅 和田田 刘 健

（河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001）

目的观察水飞蓟宾（SIL）对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织的保护作用并初探其可能的机制。方法取100只实验用大鼠随机分为假手术组，模型组和SIL低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）、高（400 mg/kg）剂量预处理组（n＝20），术前7 d开始灌胃给药；采用结扎冠状动脉30 min的方法建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型；再灌注6 h后，通过高分辨率超声影像系统检测舒张末期左室内径（LVIDd）和收缩末期左室内径（LVIDs）、短轴缩短率（FS）、射血分数（EF）、每搏输出量（SV）；计算心脏/体质量比并采用TTC染色法计算心肌梗死面积，生化分析法测定血清中心肌酶含量，HE染色法观察心肌组织形态结构改变，TUNEL法观察心肌细胞凋亡状况，比色法测定心肌组织中抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量。结果与模型组比较，发现经SIL中、高剂量预处理能够显著降低急性心肌梗死大鼠LVIDd并显著提高FS、EF和SV，其中SIL高剂量预处理组LVIDs显著降低；显著降低心脏/体质量比和心肌组织梗死面积；显著降低血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量；明显改善心肌组织病变和心肌组织细胞凋亡状况，显著降低心肌细胞凋亡指数（AI），显著提高抗氧化酶（SOD、CAT）活性并显著降低MDA含量，差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论SIL具有改善心功能、减轻心脏水肿、改善心肌组织病变、抑制心肌细胞凋亡、降低氧化应激损伤，提示SIL对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

水飞蓟宾 心肌缺血再灌注 心功能 细胞凋亡 氧化应激

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）是最为常见的心血管系统疾病，其中急性心肌梗死（AMI）是CHD的危急重症，致死率高居疾病谱第2位［1］，并且AMI发病率还有逐渐上升的趋势。临床上主要采取溶栓、介入手术等及时恢复血流灌注的方法，能够挽救部分AMI患者生命，但缺血再灌注损伤的存在严重影响着患者预后。心肌缺血再灌注损伤病理机制非常复杂，病理学研究发现氧化应激反应、继发性心肌细胞凋亡以及心功能异常是其发生发展的重要病理机制［2-4］，这也为我们研发能够有效防治心肌缺血再灌注损伤的新型药物提供了思路。水飞蓟宾（SIL）是一种具有抗氧化、抑制炎症反应、促进细胞再生等多种生物学作用的水飞蓟素［5-7］，王利平等［9］和张秀侠［10］研究发现SIL能够通过抑制神经细胞凋亡、降低氧化应激损伤而降低脑组织缺血再灌注损伤。但SIL是否对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用尚未见文献报道。本实验于2016年3月至2016年6月开展，通过建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型并于术前灌胃给予不同剂量的SIL，探讨SIL是否对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织具有保护作用并初探其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用SD大鼠（雄性，SPF级，体质量250~300 g，鼠龄8周龄）购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 试药与仪器 水飞蓟宾胶囊（天津天士力制药股份有限公司，药品规格：35mg/粒，批号：20150709）；AST、CPK、LDH试剂盒，HE、TUNEL染色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号为：150518、150324、150602、141225、150130）；SOD、CAT、MDA试剂盒 （南京建成生物工程研究所，批号为：20151613、20150109、20150526、20141218）；TTC（美国Sigma公司，批号：M2128）。动物人工呼吸机（DW-2000型，上海恒勤仪器设备有限公司）；生物机能实验系统（BL-420S型，成都泰盟科技有限公司）；石蜡切片机（RM-2135型，德国Leica公司）；紫外-可见分光光度计（UV762型，上海楚定分析仪器有限公司）；全自动生化分析仪（BS-200型，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；高分辨率超声影像系统（Vevo 770型，加拿大Visual Sonics公司）。

1.3 分组与造模 取100只实验用大鼠随机分为假手术组、模型组和SIL低［100 mg/（kg·d）］、中［200 mg/（kg·d）］、高［400 mg/（kg·d）］剂量预处理组（n＝20），术前7 d开始灌胃给药；采用麻醉后分离并结扎冠状动脉30 min后松开动脉夹恢复血流灌注的方法建立急性心肌梗死大鼠模型，实验过程中实施心电图监测：心电图示ST段抬高或T波高耸表示心肌缺血，松开动脉夹恢复血流灌注后抬高的ST段降低或高耸的T波得以恢复表示心肌再灌注成功。再灌注6 h后，取材行各指标检测。

1.4 标本采集与检测 超声检测：各组随机取6只大鼠，采用Vevo770高分辨率超声影像系统于取材前行超声检测。检测方法：于左侧胸骨旁取左室乳头肌水平短轴切面，测量舒张末期左室内径（LVIDd）、收缩末期左室内径（LVIDs）、短轴缩短率（FS）、射血分数（EF）、每搏输出量（SV），所有检测指标均取连续3个心动周期的平均值。心脏/体质量比及心肌组织梗死面积的测定：取超声检测所取各组6只大鼠，称量体质量，麻醉后开胸取心脏组织并称质量，计算心脏/体质量比；心脏组织称量完成后，置于-20℃冰箱冷冻20 min后进行切片（厚度约2 mm），置于2%TTC溶液中（37℃恒温箱、避光）孵育15 min，经处理后梗死区呈灰白色而正常组织呈红色，然后通过BI-2000医用图像分析系统（成都泰盟软件有限公司）分析心肌组织梗死面积。血清中心肌酶含量的测定：于开胸取心脏组织前，开腹经腹主动脉取血并离心（1500 r/min，10 min）取血清，通过生化分析仪测定血清中心肌酶 （AST、CPK、LDH）含量。心肌组织形态结构改变及心肌细胞凋亡状况的观察：各组大鼠随机选取6只，取心脏组织并置于4%多聚甲醛溶液中72 h进行固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡水化处理后，经常规HE染色后通过显微镜观察心肌组织病理性形态结构改变。石蜡切片经脱蜡水化处理后，按照TUNEL说明进行操作，通过光学显微镜观察各组大鼠心肌细胞凋亡状况。计算凋亡指数（AI）：每张染色切片选取不重叠的6个视野，分别计数每个视野中的细胞总数和凋亡细胞数，各组取平均值后计算AI：AI（%）=（阳性细胞数/细胞总数）× 100%。测定抗氧化酶活性和MDA含量：取各组剩余8只大鼠取心脏组织，剪碎后加入适量冷裂解液进行研磨匀浆，经离心（3000 r/min，10 min）后取上清液，采用比色法，通过紫外-可见分光光度计测定各组大鼠心肌组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和MDA含量。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（s）表示，两组间均数比较采用LSD-t检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠超声检测结果比较 见表1。与假手术组比较发现模型组大鼠LVIDd、LVIDs显著升高（P＜0.05或P＜0.01），FS、EF、SV显著降低（P＜0.01）；而与模型组比较发现经SIL中、高剂量预处理能够降低心肌缺血再灌注损伤大鼠LVIDd并显著提高FS、EF和SV（P＜0.05或P＜0.01）；经SIL高剂量预处理能够显著降低LVIDs（P＜0.05）。

表1 各组大鼠超声检测结果比较（s）

表1 各组大鼠超声检测结果比较（s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别 n假手术组 6模型组 6 SIL低剂量预处理组 6 EF（%） SV（μL）73.11±9.42 187.08±26.84 29.75±6.82**77.46±16.80**33.50±7.06 86.93±18.42 SIL中剂量预处理组 6 6.81±0.29△5.57±0.36 23.91±5.24△41.92±8.15△△105.78±20.46△SIL高剂量预处理组 6 6.74±0.28△5.04±0.32△28.70±5.91△△46.18±8.47△△124.90±23.85△△LVIDd（mm）LVIDs（mm） FS（%）6.69±0.28 3.86±0.29 43.09±7.45 7.30±0.32*6.19±0.38**15.34±3.09**7.06±0.35 6.02±0.34 19.28±4.13

2.2 各组大鼠心脏/体质量比和心肌组织梗死面积比较 见表2。与假手术组比较发现模型组大鼠心脏/体质量比和心肌组织梗死面积均显著升高（P＜0.01），而与模型组比较发现经SIL中、高剂量预处理能够显著降低心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏/体质量比和心肌组织梗死面积（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠心脏/体质量比和心肌组织梗死面积比较（s）

表2 各组大鼠心脏/体质量比和心肌组织梗死面积比较（s）

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2.3 各组大鼠血清中心肌酶含量比较 见表3。与假手术组比较发现模型组大鼠血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量显著升高（P＜0.05），而与模型组比较发现经SIL中、高剂量预处理能够显著降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中AST、CPK、LDH含量（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各组大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比较（U/L，s）

表3 各组大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比较（U/L，s）

CPK LDH 534.7±86.2 609.5±100.2 1109.5±245.0**1105.4±207.6**951.7±208.4 913.2±176.8 809.5±170.3△△774.5±165.1△726.4±138.6△△695.6±142.9△△

2.4 各组大鼠心肌组织病理性形态结构改变观察结果 见图1。与假手术组比较发现模型组大鼠呈现心肌纤维紊乱；心肌细胞呈数量减少，空泡变性，胞核固缩、深染等病理性形态结构改变；而与模型组比较发现SIL各治疗组大鼠心肌组织病变呈不同程度减轻，以SIL高剂量组治疗效果最为显著。

图1 各组大鼠心肌组织病理性形态结构改变（HE染色，400倍）

2.5 各组大鼠心肌细胞凋亡状况及AI计算结果 见图2。与假手术组比较发现模型组大鼠心肌组织凋亡细胞数量明显增多，而与模型组比较发现SIL各治疗组大鼠心肌细胞凋亡数量呈不同程度显著减少，以SIL高剂量预处理组效果最为显著。计算AI并进行数理统计分析：假手术组、模型组和SIL低、中、高剂量预处理组大鼠 AI分别为 （3.4±1.1）%、（57.1±9.8）%、（46.9±10.2）%、（27.4±6.5）%、（21.3±5.7）%；与假手术组比较发现模型组大鼠心肌组织细胞AI显著升高 （P＜0.01），而与模型组比较发现经SIL中、高剂量预处理能够显著降低心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞AI（P＜0.01）。

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡状况（400倍）

2.6 各组大鼠心肌组织中抗氧化酶活性和MDA含量比较 见表4。与假手术组比较发现模型组大鼠抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性显著降低（P＜0.01），MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较发现经SIL中、高剂量预处理能够显著提高心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中SOD、CAT活性 （P＜0.05或P＜0.01）并显著降低MDA含量（P＜0.01）。

3 讨 论

水飞蓟宾（SIL）是一种具有多种生物学作用的水飞蓟素［5-7］，本实验通过灌胃给予SIL进行预处理、夹闭冠状动脉30 min后松夹恢复血流再灌注的方法制备的心肌缺血再灌注损伤大鼠模型进行研究发现，经SIL预处理能够显著缓解心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏水肿、降低心肌梗死面积、抑制细胞凋亡、改善心肌组织病变，提示SIL对缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用。

表4 各组大鼠心肌组织抗氧化酶活性和MDA含量比较（s）

表4 各组大鼠心肌组织抗氧化酶活性和MDA含量比较（s）

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心脏组织超声影像检测是最直接反应心功能的方法［11-12］，而血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量则能够反映心肌细胞损伤程度、间接反映心功能状况［13］。本实验研究发现，经SIL预处理能够有效降低心肌缺血再灌注损伤大鼠舒张末期左室内径（LVIDd）和收缩末期左室内径（LVIDs），提高短轴缩短率（FS）、射血分数（EF）、每搏输出量 （SV），降低血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量，提示SIL具有抑制心肌细胞损伤、改善AMI大鼠心功能的作用。

氧自由基（ROS）代谢失常是导致机体氧化应激损伤的病理基础，抗氧化酶（SOD、CAT）对维持体内ROS动态平衡发挥着重要的作用［14-16］，而抗氧化酶活性降低时将导致ROS过剩而引起机体过氧化损伤生成丙二醛（MDA），所以氧化酶活性和过氧化终产物MDA含量能够反映机体氧化应激损伤程度［17］。本实验研究发现，经SIL预处理能够显著改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性、降低MDA含量，提示SIL预处理具有降低心肌缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的作用。

综上所述，SIL具有改善心功能、减轻心脏水肿、改善心肌组织病变、抑制心肌细胞凋亡、降低氧化应激损伤，提示SIL对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用；下一步将对SIL对心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制进行深入探讨。

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Study of Silibinin on the Myocardial Tissue in the Rats with Ischemia-Reperfusion Injury

CAO Xudan，REN Chunmei，HE Tiantian，et al.Handan Central Hospital，Hebei，Handan 056001，China.

Objective：To investigate the effects of Silibinin （SIL）on the myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods：100 rat models were randomly divided into sham operation group，model control group and SIL low-dose［100 mg/（kg·d）］，medium-dose［200 mg/（kg·d）］，high-dose［400 mg/（kg·d）］pre-treated group（n= 20）.The drugs were given by intragastric administration before operation；the rat models with acute myocardial infarction were made by clamping the artery.6h after reperfusion，the LVIDd，LVIDs，FS，EF，SV were detected by high frequency ultrasound imaging system；the ratio of heart weight/body weight was detected，the areas of myocardial infarction was analyzed by TTC staining，the content of enzymes in serum were determined，the histopathological changes were observed by HE staining，the cardiomyocyte apoptosis was observed by TUNEL，the activity of antioxidase and the content of MDA in myocardial tissue were determined by colorimetry.Results：Compared with model control group，the LVIDd，LVIDs in SIL medium-and high-dose per-treated groups were significantly decreased，the FS，EF，SV were significantly increased；the ratio of heart weight/body weight and the myocardial infarction areas were significantly decreased，the content of AST，CPK，LDH in serum were significantly decreased，the physiological changes and the myocardial cardiomyocyte apoptosis were significantly improved，the AI were significantly decreased；the activity of SOD，CAT in myocardial tissue were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased，all of the difference above were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：SIL can effectively improve the cardiac function，lower the cardiac edema，improve histopathological changes and cardiomyocyte apoptosis，and depress oxidative stress，which suggest that SIL has protective effects on the myocardial ischemia-reperfusion injury.

Silibinin；Myocardial ischemia-reperfusion；Cardiac function；Apoptosis；Oxidative stress

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0405-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.009

2016-12-06）

邯郸市科学技术研究与发展计划项目（1523108145）

△通信作者（电子邮箱：hdzxyycxd@163.com）