肾脑复元汤对MCAO大鼠脑保护作用及cyt-C，Caspase-9，Caspase-3的影响*

胡国恒刘 侃尹美美葛臻略

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

·研究报告·

肾脑复元汤对MCAO大鼠脑保护作用及cyt-C，Caspase-9，Caspase-3的影响*

胡国恒1△刘 侃2尹美美2葛臻略2

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

目的探究肾脑复元汤对MCAO大鼠脑保护作用，探讨其脑保护机制与cyt-C，Caspase-9，Caspase-3表达的关系。方法72只SD大鼠造模成功后随机分为假手术组、模型组、中药组，根据治疗后处死时间每组再随机分为3、7、14 d 3个亚组，比较各组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积，并采用Western blot法检测各组脑组织cyt-C，Caspase-9，Caspase-3的蛋白表达。结果各时间点神经功能缺损评分比较显示，中药组较模型组有明显下降（P＜0.05或P＜0.01）；脑梗死体积比较显示，中药组在各时间点脑梗死体积均明显小于模型组 （P＜0.01）；中药组3、7、14 d脑组织cyt-C、Caspase-9、Caspase-3表达均低于模型组 （P＜0.05或P＜0.01）。结论肾脑复元汤能促进MCAO大鼠神经功能恢复，减小脑梗死体积，其机制可能通过抑制线粒体cyt-C释放，减少Caspase-9、Caspase-3表达发挥对MCAO大鼠脑保护的作用。

脑保护 肾脑复元汤 细胞色素C Caspase-9 Caspase-3

缺血性中风又称脑梗死，是指各种原因所致脑部血液供应障碍，导致局部脑组织缺血、缺氧性坏死，进而出现相应神经功能缺损的一种疾病［1］。线粒体作为能量工厂为细胞活动提供必要能量，同时还具有传递电子、贮存钙离子、抗氧化等重要生理作用。研究发现，线粒体在细胞凋亡过程中起着中心调控作用，可以通过调控细胞色素C（cyt-C）的释放，激活半胱氨酸-门冬氨酸特异蛋白酶（Caspase）通路，掌控着细胞的生存或死亡［1-2］。肾脑复元汤具有补肾益气、活血祛瘀的功效，本课题组前期研究发现，肾脑复元汤能通过抑制炎症因子释放，促进神经营养因子表达，改善脑缺血大鼠神经功能，从而起到脑保护作用［3-4］。本研究拟从肾脑复元汤对cyt-C，Caspase-9，Caspase-3表达的影响，探讨肾脑复元汤对MCAO大鼠脑保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠72只，体质量（260±20）g，斯莱克景达实验动物公司提供，许可证号：SYXK（湘）2011-0003，饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，许可证号：SYXK（湘）2009-0001。

1.2 试药与仪器 肾脑复元汤：熟地黄10 g，黄芪30 g，山茱萸10 g，山药15 g，川芎10 g，红景天20 g，丹参10 g，牡丹皮10 g，赤芍10 g，当归尾10 g，地龙10 g。所用药物均为道地药材，购于湖南中医药大学第一附属医院。采用自动煎药壶煎煮，煎煮方法：第一煎加水500 mL，煎取200 mL汤汁；第二煎加水300 mL，煎取150 mL汤汁；2次汤药混合后置于60℃水浴锅内蒸发浓缩至含生药2 g/mL，待冷却后置于4℃冰箱冷藏备用。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（索莱宝生物科技有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物科技有限公司），cyt-C兔抗多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），Caspase-9兔抗多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），Caspase-3兔抗多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）；DYYBC型电泳仪（北京市六一仪器厂），GAS7301B型凝胶成像分析系统 （美国Bio-Rad公司）。

1.3 造模方法 采用改良Zea Longa线栓法制作大鼠MACO模型［5］。动物禁水、禁食24 h后用10%水合氯醛（0.35 mL/100g）腹腔注射麻醉。颈前皮肤剪毛后以络合碘消毒，从腹侧颈部正中切开皮肤，往右下方分离颈部肌肉及筋膜，暴露颈总动脉；沿颈总动脉向上分离颈内动脉和颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉，结扎颈总动脉及颈外动脉。颈总动脉剪一小孔，用专用线栓调整好角度后缓慢插入颈内动脉约20 mm处，稍有阻力时停止。大脑中动脉阻断成功2 h后采用Zea Longa5分制进行神经功能评分，分值在1~3分者为造模成功。假手术组麻醉后仅分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，不插线，不结扎血管。实验中使用恒温垫加温，电子体温计监测，使大鼠体温维持在（37.0±0.5）℃。

1.4 分组及给药 所有SD大鼠参照随机数字表法分为假手术组、模型组、中药组，各组再根据处死时间分为3、7、14 d 3个亚组，每个亚组8只大鼠。造模24 h后，假手术组、模型组予灌胃等量蒸馏水，中药组予肾脑复元汤灌胃。大鼠灌胃中药剂量根据成人每日服用145 g生药剂量进行体表面积比值换算［6］，灌药体积均为20 mL/kg，每日灌胃1次。经预实验已证明本方中药剂量因素对药效的影响无显著性差异，因此实验中只选用临床常规使用的中药剂量。

1.5 标本采集及检测 1）神经功能缺损评分：各组于造模后2 h及处死前采用改良大鼠神经功能缺损严重程度评分量表（m-NSS）［7］进行神经功能缺损评分，各指标评分3次取均值纳入结果。2）脑梗死体积测定：大鼠处死后迅速取出脑组织，从前囟前2 mm处，每隔2 mm做一冠状切片，共切取5个层面。将切片浸泡于2%TTC溶液中，37℃，30 min，每5分钟轻轻震荡数次。采用Image J图像分析软件计算每片脑组织梗死面积，总梗死体积=总梗死面积×脑片厚度（2 mm），并通过修正公式计算脑梗死体积百分比：梗死体积百分比（%）=［总梗死体积-（梗死侧半球体积-梗死对侧半球体积）］/梗死对侧半球体积×100%。3）脑组织cyt-C，Caspase-9及Caspase-3蛋白表达：Western blot法检测，取各组冻存于-80℃冰箱的脑组织，加入细胞裂解液后采用超声匀浆15 min，离心5 min，取上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度。各组取上清制备 50 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转NC膜，分别加入cyt-C，Caspase-9，Caspase-3一抗抗体，37℃孵育2 h；TBST洗膜3次，分别加入辣根酶标记二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光液显色。以β-action作为内参计算各组cyt-C，Caspase-9，Caspase-3条带的灰度比值。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计学软件。计量资料以（s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组神经功能缺损评分比较 见表1。结果示，两组在各时间点神经功能缺损评分与治疗前比较均有下降（P＜0.05或P＜0.01）。中药组在给药后第3、7、14天神经功能缺损评分与模型组同时间点比较下降更显著（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组神经功能缺损评分比较（分，s）

表1 各组神经功能缺损评分比较（分，s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组同期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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2.2 各组脑组织梗死体积比较 见图1，图2。结果示，给药3 d后中药组脑梗死体积小于模型组（P＜0.05）；给药7 d及14 d后，中药组脑梗死体积明显小于模型组（P＜0.01）。

2.3 各组不同时间段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达比较 见表2，图3。结果示，假手术组cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各时间点表达均差别不大（均P＞0.05），模型组、中药组cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各时间点表达均高于假手术组（均P＜0.01）。组内各时间点比较显示，模型组、中药组第3、7、14天cyt-C、Caspase-9、Caspase-3表达逐渐降低，组内比较有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）。中药组与模型组相应时间点组间比较显示，中药组cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各时间点表达均低于模型组，组间比较有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）。

图1 第7天各组大鼠脑组织TTC染色

图2 各组脑组织梗死体积比较与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

图3 各组不同时间段cyt-C，Caspase-9，Caspase-3蛋白表达比较

3 讨 论

缺血性中风是以脑动脉硬化为基础，以神经功能缺损为主要表现的脑血管疾病，是我国目前三大致死致残疾病之一［7］。中医学对缺血性中风的病因病机早有认识，认为情志、痰瘀、气虚、毒邪以及脏腑亏虚均可导致中风。《灵枢·经脉篇》曰“髓与脑，皆精之类，精成而脑髓生”。说明脑为髓海，由肾精充盈汇聚而成，证实了肾与脑的化生关系。病机上《素问·逆调论》认为“肾不生，则髓不能满”。说明肾气亏虚，髓海失养，是导致脑病的基本病机。基于如上理论基础，本课题组提出“从肾治脑、肾脑同治”理论，在补阳还五汤基础上化裁而成肾脑复元汤，具有补肾益气、活血祛瘀的功效，在临床研究及动物实验中均取得良好效果［8-9］。

表2 各组不同时间段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达比较（s）

表2 各组不同时间段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达比较（s）

与假手术组同时间比较，**P＜0.01；与模型组同时间比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与本组治疗第3天比较，&P＜0.05，&&P＜0.01。

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肾脑复元汤药物组成主要有熟地黄、山茱萸、山药、黄芪、红景天、牡丹皮、当归尾、赤芍、地龙、丹参、川芎。方中以熟地黄、黄芪为君药，熟地黄能养阴填精益髓，黄芪能大补元气，两者合用，精聚而生髓，气行则瘀去。山药补脾胃而养气阴，山茱萸益肝肾而填精髓，共为臣药；山茱萸与熟地黄合用助其补养肝肾，取“肝肾同源”之意。牡丹皮、赤芍、红景天、当归尾皆为活血之药，且以丹皮、赤芍之凉血活血制山茱萸之性温，以当归尾养血活血之力助黄芪补气行血之功，红景天既能健脾益气，又可活血化瘀，以上4味皆为佐药。地龙入经络能搜风邪，入血脉能行气血，帅诸药通行全身，活血通络。全方诸药合用，共奏补肾益气、活血祛瘀之效。

中风数小时内，脑组织被快速摧毁，大约每分钟有190万个神经元因缺血缺氧发生凋亡，同时有140亿个神经突触坏死［10］。线粒体的变化是决定细胞凋亡的关键，细胞凋亡过程中的多个重要程序都与线粒体密切相关，其中包括cyt-C的释放及Caspase家族的激活［11］。Cyt-C位于线粒体内膜外侧，在线粒体受损后释放分泌到细胞质中，启动细胞凋亡机制，是哺乳动物细胞体内细胞凋亡关键因素［12］。Caspase家族蛋白以非活性酶原形式存在于细胞质中，当细胞凋亡发生时，通过逐级活化蛋白水解，获得生物活性，促进凋亡进程［13］。研究表明，释放到细胞质的cyt-C与Apaf-1结合后形成Apaf-1-cyt-C复合体，其氨基酸CARD与Caspase-9酶原的CARD相互作用后形成复合体，在ATP的协助下活化Caspase-9酶原［14］，活化的Caspase-9进一步激活Caspase-3。Caspase-3是细胞凋亡的效应蛋白，特异性地加速凋亡进程［15］。由此可见，神经细胞缺氧损伤后，线粒体受损，导致cyt-c的释放，并激活Caspase-9及Caspase-3是引起中风后细胞凋亡的重要机制。

本研究显示，中药组在给药后第3、7、14天神经功能缺损评分与模型组同时间点比较均有下降，脑梗死体积在相应时间点明显小于模型组，说明肾脑复元汤具有明确的脑保护作用。进一步研究发现，肾脑复元汤能抑制线粒体cyt-C释放，减少大鼠脑组织Caspase-9及Caspase-3的活化表达，是其减轻神经细胞损伤，保护脑细胞的潜在机制之一。

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Effect of Shennao Fuyuan Decoction on Cerebral Protection and Cyt-C，Caspase-9，Caspase-3 Expression in MCAO Rats

HU Guoheng，LIU Kan，YIN Meimei，et al.The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

Objective：To investigate the cerebral protection effect of Shennao Fuyuan decoction，find out its relation with the regulation of cyt-C，Caspase-9，and Caspase-3 expression.Methods：72 Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into 3 groups：sham operation group，model group，traditional Chinese medicine group（TCM group）.According to the executing time of 3，7，14 days，rats in each group were divided into three subgroups.Comparison of Neurological Severity Scores（NSS），volume of cerebral infarction among these groups was made.Western blot was used to explore the expression of cyt-C，Caspase-9，Caspase-3.Results：In comparison of NSS scores at every time point，TCM groups were lower than model groups，there were statistical differences between the two groups（P＜0.05 or P＜0.01）.In comparison of infarct volume at every time point，TCM groups were much lower than model groups；there were significant statistical differences between the two groups（P＜0.01）.In comparison of protein expression of cyt-C，Caspase-9，Caspase-3 at every time point，TCM groups were lower than model groups，there were statistical differences between the two groups（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Shennao Fuyuan decoction can promote the recovery of neurological function；decrease the infarct volume in MCAO rats.This cerebral protection effect is probably related to restraining the release of cyt-C in mitochondria，and reducing the expression of Caspase-9，Caspase-3.

Cerebral protection；Shennao Fuyuan decoction；Cyt-C；Caspase-9；Caspase-3

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0384-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.003

2016-12-08）

国家自然科学基金项目（81273751，81573941）；湖南省研究生科研创新项目（CX2015B315，CX2015B326）

△通信作者（电子邮箱：hugh9198@163.com）