适于益生菌发酵的青稞酶解液制备工艺优化

万 萍易晓成 邓 娟 黄丽华

(1. 成都大学药学与生物工程学院，四川 成都 610106；2. 四川工商职业技术学院酒类与食品工程系，四川 都江堰 611830)

适于益生菌发酵的青稞酶解液制备工艺优化

万 萍1易晓成2邓 娟1黄丽华1

(1. 成都大学药学与生物工程学院，四川 成都 610106；2. 四川工商职业技术学院酒类与食品工程系，四川 都江堰 611830)

采用程序升温法对青稞进行酶解，以还原糖含量为响应值，采用响应面法对青稞酶解液制备工艺进行了优化。结果表明：按料水比1∶15(g/mL)溶解青稞粉，经糊化后冷却至45 ℃，加入8.9 U/g·青稞的α-淀粉酶和原料质量2.0%，3.5%的糖化酶、菠萝蛋白酶，保温20 min后升温到60 ℃酶解，直至碘试液体呈无色，过滤得到青稞酶解液，其还原糖、氨基酸态氮含量分别为5.68%、0.47 g/L，可作为制备益生菌发酵青稞饮料的良好基质。

青稞；酶解液；还原糖；程序升温法；益生菌发酵液

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)属于禾本科植物，主要产自中国的青藏高原，青藏高原也是世界上最早(公元前1100年)栽培青稞的地区[1]。青稞仅含少量的脂和糖，却含有较高的蛋白质、纤维素以及维生素等，其中蛋白质含量平均可达11.31%、脂肪1.80%～3.09%、淀粉含量 70%以上[2]，除含有包括8种人体必需氨基酸在内的18种氨基酸外，还含有12种微量元素如钙、镁、硒、铜、锌、铬、锰、铁、磷等[3]，其β-葡聚糖含量在3.66%～8.62%，平均值为5.25%。现代医学[2]已经证明青稞不仅营养价值高，而且在降血脂、预防糖尿病、促进胃动力等方面具有独特的保健作用。青稞既可以作为粮食，也可用于加工各类食品，如饼干、蛋糕、麦片粥、米花、青稞酒、青稞汁饮料等。

研究证明益生菌对肠道功能紊乱、呼吸感染以及过敏性症状有治疗作用[4]，同时具有调节人体免疫系统、提高乳糖的利用率、防癌、降低胆固醇等功能[5]。国外研究者如Martensson等[6]的研究证明了：在燕麦这样的非乳基质上益生菌能很好地存活和生长，并在冷藏条件下存活率较高。益生菌是定殖于宿主肠道内、当达到一定量就能对宿主产生积极作用的一类活菌。利用青稞淀粉生产益生菌发酵食品，是青稞产业化创新发展的一条新途径。益生菌不能直接利用青稞淀粉进行发酵，在生产益生菌发酵青稞饮料时，首先要将青稞淀粉进行酶解糖化，以提供能被益生菌利用的还原糖类[7]。同时，如果能先将结合于淀粉颗粒上的蛋白质降解，生成一定量的氨基酸，使酶解液有更适宜的碳氮比，则更有利于淀粉酶解，进而有效地增进益生菌的生长。

本研究拟利用由α-淀粉酶、糖化酶、菠萝蛋白酶组成的复合酶的协同作用，采用程序升温法对青稞进行酶解。采用程序升温是基于45 ℃为菠萝蛋白酶最适作用温度，而60 ℃则为兼顾α-淀粉酶和糖化酶的最适作用温度，可使液化和糖化同时进行，在产生足够还原糖的同时确保淀粉最大限度水解成可溶性低聚糊精和低聚糖，以构成益生菌发酵所需的益生元；研究不同料水比、α-淀粉酶用量、糖化酶用量和菠萝蛋白酶用量对青稞酶解液还原糖含量的影响；并以还原糖含量为响应值，采用响应面法对青稞酶解液制备工艺进行优化，以期制备出能适合益生菌发酵的青稞酶解液，并为益生菌发酵青稞饮料的进一步工业化大生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

中温α-淀粉酶：≥3 700 U/g，北京奥博星生物技术有限责任公司；

糖化酶(固体型10万U/g)、菠萝蛋白酶(50万U/g)：锐阳生物科技有限公司；

柠檬酸：食品级，市售。

1.1.2 仪器

高速万能粉碎机：FW-100型，北京中兴伟业仪器有限公司；

水浴振荡器：HZS-H型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；

电子天平：LD型，沈阳龙腾电子有限公司；

电热恒温干燥箱：DHG-9141型，上海宏精实验设备有限公司；

分析天平：BS110S型，北京赛多利斯天平有限公司；

恒温水浴锅：HH-4型，金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

青稞→粉碎、过筛→加水混匀→加热糊化→冷却→调节pH→加入α-淀粉酶、糖化酶、菠萝蛋白酶→搅拌均匀→保温酶解→灭酶→过滤→青稞酶解液

1.2.2 理化指标检验方法

(1) 还原糖的测定：直接滴定法[8]138-140，以葡萄糖计。

(2) 氨基酸态氮的测定：电位滴定法[8]198。

1.2.3 试验设计 选取影响青稞酶解的关键因素：料水比、α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠萝蛋白酶用量进行单因素试验，在单因素试验的基础上，以还原糖含量为响应值，采用响应曲面法对益生菌发酵青稞饮料酶解液制备工艺进行优化。试验结果为每组2个平行样的平均值。

(1) 料水比对还原糖含量的影响：准确称取10份过80目筛的青稞粉，每份5 g，盛于10个250 mL的三角瓶中，分为5组，每组2份做平行样，分别按料水比1∶10，1∶12.5，1∶15，1∶17.5，1∶20(g/mL)加入35 ℃的水，搅拌使其充分吸水，糊化20 min后冷却至50 ℃左右，用10%的柠檬酸调节pH至5.0左右，然后分别加入原料质量的8 U/g的α-淀粉酶，1.9%的糖化酶和3.5%的菠萝蛋白酶，放入水浴震荡器中45 ℃保温20 min，继续升温至60 ℃酶解直至碘试液体呈无色，然后在沸水浴中灭酶10 min后进行过滤，得到青稞酶解液，测定其还原糖含量，确定最适料水比。

(2)α-淀粉酶用量对还原糖含量的影响：按1.2.3(1)确定的最适料水比溶解青稞粉，除加入青稞质量1.9%的糖化酶和3.5%的菠萝蛋白酶外，分别按4，6，8，10，12 U/g·青稞的比例加入α-淀粉酶，其它同1.2.3(1)，测定其还原糖含量，以确定最适α-淀粉酶用量。

(3) 糖化酶用量对还原糖含量的影响：按1.2.3(1)确定的最适料水比溶解青稞粉，除加入8 U/g·青稞的α-淀粉酶和3.5%的菠萝蛋白酶外，分别加入青稞质量的1.3%，1.6%，1.9%，2.2%，2.5%的糖化酶，其它同1.2.3(1)，测定其还原糖含量，以确定最适的糖化酶用量。

(4) 菠萝蛋白酶用量对还原糖和氨基酸态氮含量的影响：按1.2.3(1)确定的最适料水比溶解青稞粉，除加入8 U/g·青稞的α-淀粉酶和1.9%的糖化酶外，每组分别加入青稞质量2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%的菠萝蛋白酶，其它同1.2.3(1)，测定还原糖和氨基酸态氮的含量，以确定最适菠萝蛋白酶用量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料水比对还原糖含量的影响 水是物料和酶的溶剂，生化酶促反应都须在水中进行，料水比影响酶促反应底物浓度进而影响青稞中蛋白质和淀粉的酶解，以及最终制得的酶解液中还原糖和氨基酸态氮的含量。本研究考察了料水比对青稞酶解液中还原糖含量的影响，结果见图1。

由图1可知，酶解液中的还原糖含量随料水比的增加而减少。还原糖含量直接影响益生菌的生长以及发酵后产品的酸度，在一定范围内还原糖含量越高经发酵后生成的酸也越多，酸度也就越高，反之亦然。酸度过高影响口感和稳定性，过低又达不到要求；通常可通过料水比控制酶解液中还原糖含量以达到设计产品的要求。在料水比为1∶15(g/mL)时，还原糖含量为5.54%，能符合设计产品的要求，因此，确定最适料水比为1∶15(g/mL)。

2.1.2α-淀粉酶用量对还原糖含量的影响α-淀粉酶又称液化酶，作用于淀粉后其主要产物是糊精，糊精在α-淀粉酶和糖化酶的协同作用下生成还原糖和少量低聚糖[9]。本研究考察了α-淀粉酶用量对还原糖含量的影响，结果见图2。

由图2可知，当α-淀粉酶用量小于8 U/g·青稞时，还原糖含量随α-淀粉酶用量的增加呈上升趋势；α-淀粉酶的用量为8 U/g·青稞时，还原糖含量达到了最高值(5.57%)；α-淀粉酶用量高于8 U/g·青稞后，还原糖含量随着α-淀粉酶用量的增加趋于稳定且略有下降，说明α-淀粉酶用量过多会抑制其酶活。所以，确定α-淀粉酶的最适用量为8 U/g·青稞。

2.1.3 糖化酶用量对还原糖含量的影响 糖化酶可使淀粉的α-1，4-和α-1，6-糖苷键水解而生成葡萄糖，同时还能水解糊精、糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖[10]。本研究考察了糖化酶用量对还原糖含量的影响，结果见图3。

由图3可知，当糖化酶用量小于1.9%时，还原糖含量随糖化酶用量的增加呈上升趋势；糖化酶用量为1.9%时，还原糖含量达到了最大值(5.59%)；糖化酶用量高于1.9%后，随着糖化酶用量的增加，其还原糖含量趋于稳定。所以，确定糖化酶的最适用量为1.9%。

2.1.4 菠萝蛋白酶用量对还原糖和氨基酸态氮含量的影响

青稞中含有淀粉颗粒结合蛋白，利用菠萝蛋白酶水解蛋白质为氨基酸，不仅为酶解液提供了菌体生长所需的速效氮源，同时也有利于淀粉的酶解，提高酶解液中还原糖含量，使酶解液含有适宜的碳源和氮源，更有利于益生菌的生长和发酵，并提高益生菌青稞发酵饮料的营养价值[10]。本研究考察了菠萝蛋白酶用量对还原糖和氨基酸态氮含量的影响，其结果见图4。

由图4可知，菠萝蛋白酶可以明显提高酶解液中氨基酸态氮和还原糖的含量，当菠萝蛋白酶用量小于3.0%时，随着酶用量的增加，氨基酸态氮和还原糖含量均呈增长的趋势；当菠萝蛋白酶用量为3.0%时，氨基酸态氮和还原糖的含量均达到最高值，分别为0.45 g/L和5.65%；当菠萝蛋白酶用量大于3.0%时，随着酶用量的增加，还原糖含量趋于稳定，而氨基酸态氮含量则略有降低。因此，最适菠萝蛋白酶用量确定为3.0%。

2.2 响应面优化酶解工艺试验

2.2.1 响应面法试验设计及结果 依据Box-Behken试验设计的统计学要求，以α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠萝蛋白酶用量3个因素为自变量，以还原糖含量为响应值，设计了三因素三水平的响应面试验组[11-12]，试验因素水平见表1。

根据试验因素和水平的相关要求，设计了17 次试验，其试验结果见表 2。

2.2.2 响应面试验结果与分析 应用Design-Expert 8.0.5.0统计软件，对表2中的试验数据进行二次回归分析，得到α-淀粉酶用量A、糖化酶用量B、菠萝蛋白酶用量C3个因素与还原糖百分含量Y之间的多元二次回归方程为：

Y=5.65+0.031A+0.040B+0.036C+0.015AB-0.012AC-0.015BC-0.029A2-0.037B2-0.004 25C2。

(1)

表3为Design-Expert 8.0.5.0统计软件分析得出的多元二次回归模型系数显著性检验结果。

运用Design-Expert 8.0.5.0 软件对表2的数据进行分析，得出二次回归方程的响应面及等高线图见图5～7。

由图5可知，α-淀粉酶用量和糖化酶用量对还原糖含量均有较大影响，且糖化酶用量对还原糖含量的影响大于α-淀粉酶用量的影响；等高线图椭圆度较大，说明α-淀粉酶用量和糖化酶用量两因素间交互作用显著。

由图6可知，菠萝蛋白酶用量对还原糖含量的影响大于α-淀粉酶用量的影响；等高线图椭圆度较大，说明α-淀粉酶用量与菠萝蛋白酶用量两因素间交互作用显著。

由图 7 可知，糖化酶用量和菠萝蛋白酶用量对还原糖含量均有较大影响，且糖化酶用量对还原糖含量的影响大于菠萝蛋白酶用量的影响；等高线图的椭圆度较大，说明糖化酶用量和菠萝蛋白酶用量两因素间交互作用显著。

2.2.3 最佳工艺条件的验证

由Design-Expert 8.0.5.0软件得到优化后的青稞酶解液制备工艺，确定最佳工艺参数为：料水比1∶15(g/mL)，糖化酶用量2.03%，α-淀粉酶用量8.90 U/g·青稞，菠萝蛋白酶用量3.50%，预测的还原糖含量为5.69%。根据最佳酶解工艺参数，考虑实验的可操作性，以料水比1∶15(g/mL)，糖化酶用量2.0%，α-淀粉酶用量8.9 U/g·青稞，菠萝蛋白酶用量3.5%，进行3组平行实验，实验测得值还原糖含量为5.68%，与理论值的相对误差为0.17%；其氨基酸含量为0.47 g/L。采用响应面法优化法得到的青稞酶解液制备的最佳工艺条件与实际相符合。

3 结论

(1) 本研究采用程序升温法对青稞进行酶解，运用响应面法对青稞酶解液制备工艺进行了优化，结果表明α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠萝蛋白酶用量3个因素对青稞酶解液的还原糖含量均有极显著影响，3个因素两两间的交互作用对还原糖含量也有显著影响。益生菌发酵青稞酶解液的最佳工艺条件为：按料水比1∶15(g/mL)溶解青稞粉，经糊化后冷却至45 ℃，加入8.9 U/g·青稞的α-淀粉酶和原料质量2.0%，3.5%的糖化酶、菠萝蛋白酶，保温20 min后，再升温到60 ℃保温酶解直至碘试液体呈无色，过滤得到青稞酶解液，此条件下制备的青稞酶解液的还原糖、氨基酸态氮含量分别为5.68%、0.47 g/L。

(2) 本研究利用由α-淀粉酶、糖化酶、菠萝蛋白酶组成的复合酶协同作用和程序升温法对青稞进行酶解，使所制得的酶解液中同时含有碳源、氮源和益生元，可作为制备益生菌发酵青稞饮料的良好基质。

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Optimizationon preparation technology of highland barley enzymolysis liquid suitble for probiotic fermentation

WAN Ping1YIXiao-cheng2DENGJuan1HUANGLi-hua1

(1.CollegeofPharmacyandBiologicalEngineering,ChengduUniversity,Chengdu,Sichuan610106,China; 2.DepartmentofWineandFoodEngineeringSichuanTechnologyBusinessCollege,Dujiangyan,Sichuan611830,China)

The program warming method was applied to carry out the enzymatic hydrolysis of highland barley. The response surface methodology was used to optimize the enzymatic hydrolysis process of probiotic fermented barley with the reducing sugar content as the response value. The result indicated that the optimal conditions could be gotten: with the ratio of solid to liquid 1∶15(g/mL) to dissolve highland barley powder, pasting and cooling to 45 ℃, addition of 8.9 U/gα-amylase, 2.0% glucoamylase, 3.5% bromelain, incubating for 20 min and then heating to 60 ℃, incubating for saccharification to the iodine test showing colorless, getting highland barley enzyme saccharification liquid by filtration. Under the condtion, the content of reducing sugar was up to 5.68% and the content of amino acid nitrogen was 0.47 g/L, which could be used to produce probiotic fermented highland barley beverage.

highland barley; enzymatic hydrolysate; reducingsugar; program warming method; probiotic fermentation liquid

四川省教育厅科研项目(编号：12ZA205)

万萍，女，成都大学副教授。

易晓成(1962—)，男，四川工商职业技术学院讲师。 E-mail:562248038@qq.com

2016-12-22

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.036