环境微生物DNA提取方法研究进展

阳 静张 静 邹 伟 赵兴秀 赵长青

(1. 四川理工学院，四川 自贡 643000；2. 酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000)

环境微生物DNA提取方法研究进展

阳 静1,2张 静1,2邹 伟1,2赵兴秀1,2赵长青1,2

(1. 四川理工学院，四川 自贡 643000；2. 酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000)

环境微生物DNA提取是应用分子生物学技术研究微生物群落的基础，DNA提取的纯度及其结构完整性直接影响后续试验结果。环境样品多种多样，包括水样、土壤、活性污泥、传统发酵食品、白酒酿造环境等，使得DNA的提取方法没有统一的标准。目前DNA的提取方法有很多，大致可以分为直接提取法和间接提取法。直接提取法操作简便，耗时短，而杂质较多；间接提取法操作复杂，耗时长，但纯度较高。文章在对比各种DNA提取方法的基础上，重点介绍了白酒酿造环境中DNA的提取方法和大片段DNA的提取及其研究进展。

DNA提取；白酒酿造；大片段DNA

从1953年J.D.Watson和F.H.C.Crick发现了DNA分子双螺旋结构到现在，随着分子生物学的发展，人们对DNA的了解越来越多。而要想研究其性质特点，从生物中提取DNA是一种重要的方式。目前，虽然从单一生物体内提取DNA的方法逐渐成熟，但对于复杂的环境微生物来说同时提取多种微生物的DNA仍然是一个很大的挑战，故选择一种较好的提取方法尤为重要。判断一个好的提取方法不仅仅是看其提取出来的DNA含量、纯度以及分子大小，其提取出来的DNA能否充分反映该环境中微生物种群多样性也是关键。本文在对比了各种微生物DNA提取方法的基础上，重点介绍了白酒酿造环境中DNA的提取方法和大片段DNA的提取以及其研究进展，旨在为白酒酿造环境及其他环境微生物的DNA提取方法作出较为系统的总结，为从白酒酿造环境或其他类似环境中提取DNA提供参考。

1 DNA常规提取方法

基因组DNA的提取方法一般分为两类，即直接提取法和间接提取法。直接提取法，即利用各种物理与化学方法直接从环境样品中裂解细胞，再从中提取DNA。Ogram等[1]曾运用直接法将环境中的微生物DNA抽提出来。直接法操作相对简便，不需要分离细胞，提取出来的DNA也更具代表性。然而，直接法虽然产量较高，纯度却一般较低，因为在其提取DNA的过程中，也会将其中含有的抑制剂像腐殖酸、褐菌酸等一起提取出来，进而干扰或抑制了后续操作。间接提取法又叫细胞抽提法[2]，即先将细胞从环境中分离出来再从中提取DNA。Torsvik等[3]报道了间接提取法。间接提取法提取出来的DNA虽然纯度较高，然而操作较为复杂，并且提取出来的DNA分子量远远少于直接法提取出来的。故对于选择直接法还是间接法提取DNA的关键在于预处理。

1.1 预处理

在某些环境(如土壤、活性污泥、海洋沉积物、大曲等)中，往往存在一系列杂质，如腐殖酸[4]、褐菌素[5]和重金属离子[6]等，而正是由于这些杂质，在进行环境微生物DNA提取时，对其产率与效率造成不同程度的抑制，因而预处理在DNA提取过程中尤为重要。此处以对腐殖酸的处理为例进行详细叙述。

腐殖酸拥有独特的结构，为极性化合物，可以抑制SDS、溶菌酶及蛋白酶K等的活性[7]。目前，去腐的方法有很多，常用的方法有硫酸铝法、PVPP法、CTAB法、氯化铯密度梯度离心法、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树脂、离子交换和高效分子量排阻层析、电洗脱等方法[8]。氯化铯密度梯度离心法与其他方法相比较复杂、昂贵且费时[9]，因此一般不选用。有人也利用焦磷酸钠(磷酸四钠)[10]和磷酸五钠(STPP)[11]与其发生反应进而将其除去。席峰等[12]在经过多种缓冲液进行预处理比较后，得出了一种优化后的脱腐缓冲液(100 mmol/L Tris，pH 10.0，100 mmol/L Na4P2O7100 mmol/L Na2EDTA，1.0% PVP，100 mmol/L NaCl，0.05% Triton X-100，4.0%脱脂奶粉)，此种缓冲液比传统的TENP等缓冲液脱腐作用更好。此外，宋培勇等[13]利用芬顿试剂(即过氧化氢与亚铁离子组成的混合溶液)在提取DNA过程中对土壤中的腐殖酸进行脱腐处理，芬顿试剂具有一定脱腐能力，并且对DNA片段降解影响不大。

1.2 细胞裂解

DNA的提取效率与细胞的裂解效率呈正相关，因此有效裂解细胞的方法对DNA的提取尤为关键，同时也需要考虑到DNA片段是否在裂解细胞的过程中受损。细胞裂解的方法主要分为三类，即物理法、化学法与生物酶法。

1.2.1 物理法 物理法即利用外力破坏细胞结构使其内容物溶出，主要有液氮冻融法、玻璃珠振荡法、液氮研磨法、超声振荡法(ultrasonication)和微波热休克法(microwave heating)等[14]。物理法由于操作较为剧烈，所以往往不容易得到大片段DNA[15]。超声法是一种较为剧烈的裂解方法，其设备费用较低、速度快、操作较为简单，且能有效提取DNA。但是其超声的时间对DNA的提取效率有比较大的影响。万晶晶等[16]发现功率为50 Hz的超声波在27 s时有最大DNA提取效率。曲艳玲[17]对液氮冻融法和液氮研磨法提取活性污泥DNA进行了对比，发现用液氮冻融法提取DNA腐殖酸等含量较低，蛋白质去除得较彻底。吕新等[18]通过比较得出利用玻璃珠振荡法提取出来的DNA量较多，但腐殖酸污染较严重。

1.2.2 化学法 化学法是利用一些化学试剂对细胞进行破壁裂解。常用的方法有十二烷基硫酸钠(SDS)法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法或两者的结合使用。SDS是一种阴离子表面活性剂，能与膜脂蛋白相互作用进而破坏细胞膜结构。而CTAB是一种阳离子去污剂，能够与核酸形成复合物[19]。比起试剂盒法，SDS法和CTAB法成本低，DNA产量高、降解少[20]。此外，Faria Fatima等[21]在SDS与CTAB结合的情况下，又添加了甘露醇后提取的DNA产量高且腐殖酸的污染较小。

1.2.3 生物酶法 生物酶法是利用溶菌酶、蜗牛酶、蛋白酶K等裂解细胞。一般情况下，化学法与酶法联合使用效果更好[15]。

一般来说，在加入溶菌酶后，控制温度在37 ℃左右，而添加蛋白酶K后，控制温度在60 ℃左右[22-23]。然而，将蛋白酶K置于37 ℃下[24]，或将溶菌酶置于65 ℃下[25]，也能提取到较长的DNA片段。曲衍洪等[26]发现在环氧丙烷皂化废水活性污泥中溶菌酶最适温度为45 ℃，而非一般认为的37 ℃，表明在不同的环境中提取DNA，酶的最适作用温度也会发生变化。

通常会用上述3种方法或2种方法结合起来提取DNA，如闫亮珍等[14]将化学—物理法与酶—化学—物理法相比较，得出酶—化学—物理法提取的DNA能更好地体现生物多样性，且操作上更方便、简洁。王晓辉等[6]对化学法与酶—化学法进行了比较，结果证明化学—酶法既得到了大片段DNA，又保证了DNA的高浓度。

1.3 蛋白质的去除

细胞裂解之后，裂解液中除了DNA外还含有大量的蛋白质，为了进一步纯化DNA，就必须除去蛋白质。一般会使用苯酚—氯仿—异戊醇(25∶24∶1)与氯仿—异戊醇(24∶1)来抽提蛋白质[27]。此外，还可以利用高盐法与苯酚—氯仿—异戊醇或氯仿—异戊醇结合除蛋白质，无论是先加盐还是后加盐，均比不加盐溶液提取的效果好[17，28]。

1.4 DNA沉淀

用来沉淀DNA的试剂一般为无水乙醇或异丙醇。用无水乙醇沉淀，通常情况下用2～3倍体积无水乙醇在-20 ℃过夜沉淀或者在-70 ℃沉淀1 h，沉淀效果比较明显，乙醇易挥发除去，但一般总体积较大。而用异丙醇沉淀，通常仅用0.5～0.6倍体积异丙醇，虽在室温下沉淀下来的DNA量多，但易使盐类共沉淀，且异丙醇难以挥发除去，必须用70%乙醇洗涤。因而在加入同样多的试剂时，异丙醇沉淀下来的DNA远远多于乙醇沉淀下来的[29]。闫建芳等[30]指出用异丙醇沉淀DNA时沉淀时间过长会降低DNA的纯度。Zhang Xin等[31]曾用异丙醇在-20 ℃下沉淀，而陈琰等[27]认为将异丙醇在-20 ℃沉淀会有盐离子共沉淀出来，影响后续操作。此外，DNA含有大量的磷酸基团而带负电，当被大量带正电荷的基团中和后更容易沉淀出来，因此异丙醇还可以结合醋酸钠[32]一起使用来增强DNA的沉淀效果。另外，Tanima Paul等[33]利用聚乙二醇(PEG)和NaCl溶液也可以达到沉淀DNA的目的。

2 白酒窖池微生物DNA的提取

白酒的生产以窖池为基础，发酵过程是庞大微生物种群在窖池的糟醅和窖泥中进行复杂物质能量代谢的过程。窖池微生物构成极其多样复杂，这些复杂的微生物在窖池中生长、繁殖、新陈代谢，产生各种代谢产物和酶，发生各种生化反应，最后形成白酒中各种呈香物质和重要有效成分。前人已经在窖池微生物的分析方面作了大量的研究，但是人们对于微生物的认识基本都是依赖于形态特征、生理学特性等传统的分类鉴定方法[34-35]，对可培养的微生物进行研究，而对占微生物总体99%以上的不可培养微生物的研究较少[36]。

宏基因组学技术的出现，使得人们对大量不可培养微生物的研究成为现实，微生物基因的可探测空间显著增大。另外，随着分子生物学技术的发展，白酒窖池微生物多样性的研究也已经不局限在可培养微生物的范围[37]。作为宏基因组学和微生物群落分子分析方法的基础，最重要的环节就是从样品中尽量提取出高质量并具有代表性的微生物总基因组DNA。

2.1 大曲中DNA提取

环境中普遍含有的腐殖酸在大曲中也存在，因而，在从大曲中提取微生物基因组DNA时需要进行脱腐处理。然而，先对曲样进行脱腐处理会使提取到的DNA总量变少[4]。不同时期的大曲曲块硬，水分较少，进而导致其具有高吸水性，如不进行蒸馏水反复洗涤，则会导致抽提液被其过度吸收，进而加入的溶菌酶等酶不起作用[14]，所以，可以先对其进行充分研磨后再加入抽提液。

对大曲提取的方法无非也是分为物理法、化学法和酶法。闫亮珍等[14]采用酶—物理—化学法提取大曲DNA，与纯物理法相比，获得了质量及纯度更好的DNA，且后续试验表明酶—物理—化学法提取获得的高质量DNA能全面反映汾酒酿造过程中的微生物群落结构多样性。

2.2 酒醅中DNA提取

就酒糟的预处理来说，因为其含有酒精等微生物的次级代谢产物，因而将对后续加入的溶菌酶、溶壁酶、蛋白酶K等活性产生不利影响，故可用无菌水对其反复洗涤，进而有利于DNA的提取[14]。而沈才萍等[38]在此基础上，采用SDS高盐+蛋白酶K的方法提取得到酒醅中的微生物总DNA，分别利用无菌水、TENP以及PBS缓冲液对糟醅进行预处理，结果证明，用PBS缓冲液预处理后获得的基因组DNA其DGGE 图谱中条带明亮、丰度高，能很好地反映样品细菌的多样性，有利于相关分子生物学分析。李德林等[39]对比了SDS高盐提取法和CTAB提取方法在酒醅中微生物基因组DNA提取的效果，发现石英砂+CTAB法获得的DNA浓度最大，而液氮+SDS+溶菌酶法获得的总DNA纯度最高。

2.3 窖泥中DNA提取

对于窖泥微生物DNA的提取是近几年才发展起来的，但并没有找到一种专有的从窖泥微生物中提取DNA的方法。窖泥水分较多，故在预处理时常采用冷冻干燥窖泥的方法[40]除去窖泥水分。边名鸿等[41]采用在高盐提取缓冲液中裂解细胞并在加入SDS、溴化十六烷基三甲铵和蛋白酶K后持续加热2～3 h的方法成功将窖泥微生物DNA提取出来，扩增古菌16S rDNA序列，构建了古菌16S rDNA文库。刘金英等[42]用不同方法提取窖泥的微生物DNA，结果表明用化学—酶法提出的DNA产率高且较纯，并且在粗提取过程中，还发现了DNA含量与液相层中的黄褐色深度呈正比关系。

3 大片段DNA的提取

环境微生物中可培养微生物仅占不到1%[43]，严重影响了人们对环境微生物的了解及利用，故建立一个宏基因组文库对微生物的研究及利用尤为重要。宏基因组揭示了生物群落多样性，进而反映了基因组的编码功能多样性，且其中绝大部分是未知基因[44]。根据插入DNA 片段的大小，宏基因组文库常常被划分为小插入片段文库和大插入片段文库两大类[45]。稳定的大片段基因组文库能保证基因簇的完整性，更利于目的基因的结构及功能分析[46]，因此大片段DNA的提取，是建立高质量宏基因组文库的关键。

大片段DNA的提取既可以利用间接提取法，也可以利用直接提取法。直接提取法相对间接提取法耗时短，但非DNA物质残留较多，且有可能对DNA进行降解，从而提取不到大片段的DNA[47]，因此在直接提取前必须进行必要的预处理，除去大部分对DNA提取有较大影响的杂质。蒋云霞等[48]通过改良后的高盐、SDS-CTAB热裂解直接提取法与电洗脱法联用能高效构建红树林土壤微生物大片段宏基因组文库，其包含克隆子的平均插入片段均大于35 kbp。但仅用CTAB、SDS等基因组DNA常用提取方法则因为提取过程需要较多步骤的震荡等操作会使基因组DNA断裂，无法获得大片段DNA。而低熔点琼脂糖包埋法则可以保护DNA免受降解，尽可能地减少裂解处理过程中的药物和机械损伤[49]，是一种高效、简便的大片段DNA制备方法。苟敏等[50]通过用琼脂糖包埋法，与试剂盒法及CTAB法对比发现，琼脂糖包埋法提取出来的DNA分子片段最长，且纯度较高。

4 总结及展望

随着人们对微生物DNA提取手段的改进，涌现了各种各样高效的提取方法。如何快速、经济地从各种复杂的样本中提取高纯度、高产量的DNA已经成为生物研究的一个非常重要的基础。而普遍适用的即为酶—化学结合法提取DNA，然而，由于在不同样品中存在样品本身各自特性的差异，还没有一种方法可以适用于所有的样品，也没有一种方法可以满足所有的后续试验的要求，故在选择DNA提取方法时，要根据样品的特性和试验的目的选择合适的方法。本文对近年来国内外的各种DNA提取方法进行比较表明：简化操作程序，缩短操作时间，减少提取过程中对DNA的损伤，保护DNA的完整性，已成为环境微生物DNA研究的发展趋势。

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Progress of Study on Extraction Methods of Environmental Microbial DNA

YANG Jing1,2ZHANGJing1,2ZOUWei1,2ZHAOXing-xiu1,2ZHAOChang-qing1,2

(1.CollegeofBioengineering,SichuanUniversityofScience&Engineering,Zigong,Sichuan643000,China; 2.LiquorMakingBio-Technology&ApplicationofKeyLaboratoryofSichuanProvince,Zigong,Sichuan643000,China)

Environmental microbial DNA extraction is the foundation of microbial community research by molecular biology techniques, and its structural integrity and the purity of DNA extracted is directly related to the subsequent experiment results. DNA extraction method is not a unified standard because of various environmental samples, including water, soil and activated sludge, the traditional fermented food, liquor-making environment, etc. Now, there are many methods of DNA extraction, they can be divided into direct and indirect extraction ones. The direct extraction methods are simple, less time-consuming, while presenting impurities. However, complex indirect extraction operations are time-consuming, but the products are pure. Based on the comparison of the different DNA extraction methods, we focus on the research progress of DNA extractions of liquor brewing environment and the large fragments.

DNA extraction; liquor brewing; large fragment of DNA

四川省教育厅项目(编号：15ZA0226)；省部级重点实验室项目(编号：NJ2014-06)；四川省教育厅项目(编号：15ZB0204)

阳静，男，四川理工学院在读本科生。

张静(1981—)，女，四川理工学院讲师，博士。 E-mail:jingzhang3019@126.com

2017-01-07

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.042