叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测对早期肺癌的诊断效能

潘世泽，汪巍，方一凡，郭小波，耿庆

(武汉大学人民医院，武汉 430060)

叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测对早期肺癌的诊断效能

潘世泽，汪巍，方一凡，郭小波，耿庆

(武汉大学人民医院，武汉 430060)

目的探讨叶酸受体(FR)阳性循环肿瘤细胞(CTC)检测对肺癌的诊断效能。方法胸部CT检查提示可疑肺癌的孤立性肺小结节患者38例，术后病理诊断为早期肺癌29例、肺良性病变9例。术前均留取静脉血检测FR阳性CTC。结果29例早期肺癌及9例肺良性病变患者的FR阳性CTC分别为(10.87±2.62)、(8.03±2.56)FU/3 mL，两者相比，P<0.05。以术后病理检查结果作为诊断肺癌的金标准，kappa一致性检验显示FR阳性CTC诊断肺结节具有一定的准确性(kappa=0.649，P<0.01)。以FR阳性CTC作为肺癌的诊断指标，其ROC曲线下面积为0.837(95%CI为0.650～1.000)，最佳截断值为8.7 FU/3 mL，诊断灵敏度为89.7%、特异度为77.8%。结论FR阳性CTC检测对早期肺癌具有较好的诊断效能。

叶酸受体；循环肿瘤细胞；叶酸受体阳性循环肿瘤细胞；肺癌；肺肿瘤

大多数肺癌确诊时已处于晚期，只能得到有限的治疗，患者5年生存率仅为15%，如果肺癌在发生早期就能诊断并完全切除，患者5年生存率将会提升至67%[1,2]。孤立性肺结节公认的定义为单一的、边界清的、影像不透明的、直径≤30 mm 的、周围完全由含气肺组织所包绕的病变，没有肺不张、肺门增大或胸腔积液表现[3]。目前临床上鉴别肺部结节的良恶性主要依靠影像学、肿瘤标志物及组织病理检查等。常用于肺癌诊断的肿瘤标志物主要有癌胚抗原(CEA)、 肿瘤相关糖类抗原、细胞角蛋白(CYFRA)片段、神经元特异性烯醇化酶(NSE)等，但在早期肺癌或者某些癌前病变中上述标志物表达量相对较低[4]，致使其诊断早期肺癌的灵敏度和特异度均不高。即使影像学检测发现肺部有小结节，做不做手术也成了一件难以抉择的事情，若肺部结节癌症倾向不明显，多根据Fleischner学会的推荐[5, 6]进行随访，但进行随访有利有弊，一些肺癌患者因为随访时间长错过了早期切除的机会。肿瘤细胞自发地从原发肿瘤和转移灶释放入血液循环中，或者由于侵入性操作导致的肿瘤细胞进入血液循环中，即为循环肿瘤细胞(CTC)[7]。CTC逃避免疫系统识别和杀伤，聚集形成微肿瘤栓，在合适的条件下发展为转移病灶[8]。虽然CTC的发现很早，但直到近几年其临床应用潜力才得到认可[9, 10]。上皮细胞黏附分子(EpCAM)是表达于人类部分正常上皮细胞和大多数恶性上皮肿瘤细胞表面的糖蛋白，目前主要通过检测EpCAM来确认CTC，但非小细胞肺癌(NSCLC)患者的CTC经常不表达EpCAM，通过检测EpCAM来确认NSCLC患者的CTC敏感性低[11]。叶酸受体(FR)在许多上皮源性恶性肿瘤细胞中高表达，尤其在肺癌和卵巢癌细胞中几乎都有表达，可采用配体靶向酶联聚合反应检测FR阳性的肺癌CTC[12～14]。本研究采用配体靶向PCR法对38例胸部CT检查提示可疑肺癌的孤立性肺小结节患者的FR阳性CTC进行了检测，并探讨分析了其对早期肺癌的诊断效能。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年6～12月武汉大学人民医院收治的可疑肺癌的孤立性肺小结节患者38例，男16例，女22例；年龄41～74岁。纳入标准：患者无症状或表现为咳嗽、胸部胀痛、低热等，胸部CT检查提示为可疑肺癌的孤立性肺部结节(结节最大直径<3 cm)，未伴有纵隔淋巴结肿大或其他转移灶；患者纳入本研究前未接受抗肿瘤药物治疗。所有患者接受手术治疗，术后病理诊断早期肺癌29例(腺癌21例、鳞癌8例，均未发现淋巴结转移灶和远处转移灶)及肺良性病变9例。排除标准：胸部CT检查提示肺多发结节者，其他部位肿瘤继发肺转移、既往接受手术及放化疗治疗者；肺部肿瘤复发患者。

1.2 FR阳性CTC的检测 纳入的38例患者在即将手术时抽取肘前静脉血3 mL，EDTA抗凝，4 ℃储存，24 h内完成血液处理并进行FR阳性CTC的检测测。首先通过免疫磁珠负向富集法从3 mL外周血中捕获CTC，然后通过配体靶向PCR法定量检测FR阳性CTC，FR阳性CTC检测试剂盒由格诺思博生物科技(上海)有限公司提供。根据试剂盒说明书，将3 mL全血样本中加入红细胞裂解液(体积∶体积=1∶4)，4 ℃裂解15 min，去除红细胞；然后加入150 μL的抗CD45磁珠和50 μL的抗CD14磁珠，4 ℃孵育30 min，分别去除白细胞和巨噬细胞；将富集的CTC加入10 μL的含有肿瘤特异性叶酸配体-寡核苷酸偶合物的探针标记液，室温孵育40 min；接着将这些样品加入1 mL的洗涤缓冲液，4 ℃、500 g离心10 min，重复3次，去除未结合的探针；最后加入120 μL的洗脱缓冲液，4 ℃孵育2 min，洗脱下已结合的探针；离心收集已结合的探针，加入24 μL的中和缓冲液，用于荧光定量PCR扩增，PCR信号与数据的收集通过ABI7300(Life Technologies, Carlsbad, CA)仪器完成(ABI7300仪器反应条件：95 ℃变性2 min，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，8 ℃冷却5 min；40个循环，95 ℃变性10 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸10s[14,15]。3 mL血液中检测到1个FR阳性CTC，就定义为1 Folate Unit(FU，这是一个自我定义的测量单位)[11]。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。两组间计量资料的比较用独立样本t检验，多个样本之间的比较用Kruskal-Wallis检验；诊断一致性分析采用kappa一致性检验；灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%，特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%；以灵敏度为纵坐标、(1-特异度)为横坐标绘制ROC曲线，利用ROC曲线计算Youden指数，将Youden指数最大的切点确定为FR阳性CTC诊断肺癌的最佳临界点。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

29例早期肺癌及9例肺良性病变患者的FR阳性CTC分别为(10.87±2.62)、(8.03±2.56)FU/3 mL，两者相比，P<0.05。

以术后病理检查结果作为诊断肺癌的金标准，kappa一致性检验显示FR阳性CTC诊断肺结节具有一定的准确性(kappa=0.649，P<0.01)。以FR阳性CTC作为肺癌的诊断指标，其ROC曲线下面积(AUC)为0.837(95%CI为0.650～1.000)，截断值为8.7 FU/3 mL，诊断灵敏度为89.7%、特异度为77.8%，说明FR阳性CTC检测对肺癌具有较好的诊断效能。

3 讨论

随着环境变化，肺癌的发生率越来越高，死亡率也排在肿瘤病死率的首位，人们逐渐开始注重体检，肺部小结节检出率较前大大提升。但肺部结节是不是肺癌的问题，是否需要立刻行手术活检还是随访，都是干扰医师和患者的问题。目前没有一种肿瘤标志物可以准确预测或诊断肺部肿瘤，特别是早期肺癌，即使多种肺癌肿瘤标志物联合检测(CEA+SCC+CYFRA21-1)，其对于早期肺癌的诊断阳性率也仅为19.4%[16]。本研究结果显示，FR阳性CTC检测对肺癌具有较好的诊断效能，其诊断早期肺癌的敏感度为89.7%，明显高于一般的肺癌肿瘤标志物。

目前已经有一些可靠且可重现的技术用于分离和检测外周血中的肿瘤细胞，然而这些方法均有不同的局限性，在临床实践中尚没有一种标准的方法来检测CTC[17]。CellSearch系统是较早用于检测CTC的标准系统，已经获得了美国食品药品管理局批准作为某些肿瘤如前列腺癌、乳腺癌患者CTC的检测，该技术是依赖上皮细胞标记物(如EpCAM)来识别CTC，然而由于上皮间质转化的存在，其对晚期肺癌患者的阳性检出率只有32%[18]。同理也很难通过EpCAM微流体CTC芯片检测到NSCLC患者的CTC。另外，可以通过肿瘤细胞的大小分离检测CTC，该技术基于细胞的形态学特征，而不利用细胞表面免疫标记物，其优点在于不依赖CTC的表面抗原，保持了CTC形态和活性，但获得的CTC 纯度很低，而且很容易丢失直径比较小的CTC。

FR具有很强的组织和肿瘤特异性，在肺癌特别是在非小细胞肺癌细胞表面高度表达，每个细胞表面的FR高达几十万个，而FR在健康人血液细胞中几乎未见有表达[19]，所以FR是理想的CTC检测靶点。本研究采用的配体靶向PCR技术是用叶酸连接的寡核苷酸进行标记并用定量PCR进行定量分析，通过这种方法，将1个CTC放大成至少50万个表面受体分子，然后通过荧光定量PCR 将这50万个分子再高保真地进行放大扩增检测，通过这两级放大，可以检测到3 mL血液样本中极少量的CTC，这即是人CTC检测试剂盒的工作原理，这种检测方法大大增加了检测CTC的敏感性。本研究用此方法检测可疑肺癌患者的CTC，也增加了本研究的可信度。

本研究共入组了29例早期肺癌患者、19例肺部良性疾病患者，研究结果显示两组受检者的FR阳性CTC差异有统计学意义。ROC曲线分析确定了8.70 FU/3 mL的FR阳性CTC为诊断早期肺癌的最佳截断值，这也与之前的大样本分析研究结论相符[12,14]。在此截断值的基础上，FR阳性CTC诊断早期肺癌的灵敏度为89.7%、特异度为77.8%，与Lian等[11]的研究结果相符(以8.70 FU/3 mL为最佳截断值，其灵敏度为82.5%，特异度为72.2%，其中对Ⅰ期肺癌的诊断灵敏度高达86.6%)。然而，却与 Wang等[15]的研究结果有所差别，在他们的研究中得出CTC灵敏度仅为77.7%，而特异度达89.5%，这可能是因为本研究入组患者胸部CT表现癌症倾向明显(将胸部CT表现为磨玻璃影、半实性结节或实性结节伴有周围不光滑的患者入组)，CTC可能释放入外周血的量较多，这也间接提示CTC检查联合胸部CT检查可能会提高肺癌诊断阳性率；此外，本研究纳入的病例较少，可能也会影响实验结果。本研究还发现，以FR阳性CTC作为肺癌的诊断指标，其 AUC值较高(0.837)，高于CEA、 NSE、 CYFRA21的AUC值(分别为0.617、 0.613、0.527。这说明FR阳性CTC更容易辨别肺结节的良恶性，较一般肿瘤标志物具有较好的诊断效能，与Lian等[11]的研究结果相符(FR阳性CTC对肺癌及Ⅰ期肺癌具有较高的诊断准确性，AUC值分别为0.859和0.912。此外，本研究kappa一致性检验结果显示FR阳性CTC诊断肺结节具有一定的准确性(kappa=0.649，P<0.01)。

CTC检测不仅在肺癌诊断中起重要作用，其在肺癌治疗评价和预后判断当中也扮演着重要角色。研究[9]发现，CTC 计数与肺癌患者无进展生存期 (PFS) 和总生存期 (OS)呈负相关关系，多因素分析显示CTC计数可预测患者的 PFS 和 OS ；另外，Krebs等[18]在对101例晚期NSCLC的研究中，应用CellSearch 系统检测CTC，CTC计数变化可作为晚于ⅢA期的NSCLC的预后判断因子，其也是预测OS的最有价值指标之一。CTC与化疗或放射治疗NSCLC的疗效也有关联，有学者[20]在对43例接受化疗的NSCLC患者的研究中发现，患者CTC计数越高，其OS和 PFS越低，提示CTC可作为评估放NSCLC化疗疗效的指标之一。本研究入组的肺癌患者也在持续随访中，将进一步观察其FR阳性CTC计数是否能够预测早期肺癌的PFS和OS。

综上所述，FR阳性CTC检测可作为筛查孤立性肺结节、诊断早期肺癌的有效生物标志物。鉴于此次纳入的病例较少，进一步进行大样本前瞻性实验来验证我们的结论是非常必要的。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.021

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耿庆(E-mail: szgqing@126.com)

2017-08-18)