HOXA3在乳腺癌组织中的表达及其对患者预后、细胞生物学特性的影响

房德芳,石微,房新建,苏琼

(1江苏省连云港中医药高等职业技术学校,江苏连云港222006;2连云港市第二人民医院)

HOXA3在乳腺癌组织中的表达及其对患者预后、细胞生物学特性的影响

房德芳1,石微1,房新建2,苏琼1

(1江苏省连云港中医药高等职业技术学校,江苏连云港222006;2连云港市第二人民医院)

目的研究同源盒基因3(HOXA3)在乳腺癌组织中的表达及其对患者预后、乳腺癌细胞生物学的影响。方法用qPCR法检测30例乳腺癌组织、癌旁组织中HOXA3 mRNA，同时对TCGA数据库中的患者根据HOXA3平均值分为HOXA3高表达与低表达，并通过生存分析比较生存率与转移率的差异。乳腺癌细胞系MCF-7随后分为CON、siRNA1、siRNA2组，分别转染无效siRNA、HOXA3 siRNA1、HOXA3 siRNA2小干扰RNA，48 h后通过qPCR、Western blotting法检测HOXA3 RNA和蛋白表达，筛选出干扰能力较强的siRNA后，将siRNA转染至MCF-7细胞中，以转染无效siRNA为CON组，使用Transwell与CCK8检测细胞迁移与增殖变化，并使用Western blotting法检测EMT标记物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白。结果HOXA3 mRNA在癌及癌旁组织中的相对表达量分别为17.50±1.44、1.0±0.05，二者比较，P<0.05。HOXA3蛋白在癌及癌旁组织中的相对表达量分别为13.42±0.18、2.57±0.04，二者比较，P<0.05。HOXA3高表达者整体生存率与转移率均降低(P均<0.05)。转染48 h后，CON组、siRNA1组、siRNA2组HOXA3 RNA相对表达量分别为1.0±0.12、0.62±0.01、0.16±0.03，三组比较，P均<0.05。CON组、siRNA2组迁移细胞数量分别为40.57±1.68、18.33±1.01，两组比较，P<0.05；与CON组比较，siRNA2组增殖能力减弱，P<0.05。与CON组比较，siRNA2组E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，Vimentin、N-cadherin、Snail蛋白表达降低(P均<0.05)。结论HOXA3在乳腺癌患者癌组织中高表达，且与患者预后、转移相关，同时HOXA3表达可减弱乳腺癌细胞迁移与增殖，这一作用可能与EMT有关。

乳腺癌；同源盒基因3；上皮-间质转化；细胞转移

乳腺癌是女性最为常见的癌症之一，占新发病例的23%及致死病例的14%[1]，目前来说，尽管对于乳腺癌的早期预防、对敏感基因如BRCA1的缺失进行检测大大提高了乳腺癌患者的5年生存时间，乳腺癌的转移依然成为一个亟待解决的问题[2]。乳腺癌转移是一个极其复杂的过程，基本步骤包括癌细胞侵袭周围组织，并通过内渗进入到循环系统，癌细胞随后堵塞于毛细血管中，并通过外渗进入到远隔器官中[3]，在这一过程中，主要的3个步骤内渗、外渗、远隔器官的生长均需癌细胞能适应相应的微环境，同时能通过上皮-间质(EMT)、间质-上皮(MET)转换实现侵袭与增殖能力的增加，EMT指细胞具有极性的上皮细胞转变为间质细胞的过程，EMT后的类间质细胞侵袭、迁移能力明显增强，同时侵入性伪足形成增多，使得细胞对细胞外基质(ECM)降解能力增强形成[4]，因此EMT过程亦被视为乳腺癌、卵巢癌等癌症细胞侵袭的重要环节，因此寻找EMT中的关键蛋白，并开发特异的抑制剂，从而达到靶向治疗的效果已成为研究热点。同源盒(HOX)基因是一类高度保守并在胚胎发育中发挥重要作用的蛋白，HOX基因共有39种，分为A、B、C、D四类，HOX的主要功能为调控细胞分裂、黏附、增殖与分化[5]，HOX基因的异常表达已在多种肿瘤中如前列腺癌[6]、结肠癌[7]、肺癌[8]等癌症中得到证实，在乳腺癌中，HOXA5、HOXA9与p53、BRCA1的调节相关[9]，而HOXA1则与乳腺癌细胞的迁移、他莫昔芬治疗抵抗相关[10]，而HOXA3在乳腺癌细胞中的表达及作用则尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料 30例人乳腺癌样本及其相应癌旁组织来自连云港市第二人民医院，样本收集过程得到连云港市第二人民医院伦理委员会批准，人乳腺癌细胞系MCF-7购自北京协和医学院实验中心，siRNA由美国Invitrogen公司合成，脂质体购自美国Invitrogen公司，TRIzol购自美国Invitrogen公司，RNA反转录试剂盒与Takara SYBR Premix Ex Taq检测试剂盒购自大连宝生生物公司(Takara)，Transwell小室购自美国Corning公司，HOXA3一抗购自美国Abcam公司，EMT标记物Snail、N-cadherin、Vimentin、 E-cadherin一抗购自美国Cell Signal Technology公司，二抗均购自北京中杉金桥公司，CCK8试剂盒购自日本Dojindo公司。

1.2 细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF-7培养于37 ℃、5%CO2孵箱中，培养基为DMEM+10%FBS，将细胞分为CON、siRNA1、siRNA2组，分别使用脂质体转染无效siRNA、siRNA1、siRNA2小干扰RNA，CON序列为5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3′ ，siRNA1序列为GCATCTTGGCTGTCTGCTAAA，siRNA2序列为GTGTCAAACCCCTGTCAGAGT，脂质体转染步骤根据Invitrogen公司说明书进行。

1.3 HOXA3 mRNA表达检测 采用Q-RT-PCR法。细胞总RNA提取使用酚-氯仿抽提法。细胞使用TRIzol裂解后，加入0.5倍体积氯仿，剧烈震荡后15 000 r/min、离心15 min，取上清。加入等体积异丙醇，冰上沉淀20 min后，12 000 r/min离心10 min，取沉淀。沉淀用75%乙醇洗2次，即得到细胞总RNA。细胞总RNA随后使用Takara 反转录试剂盒反转录为cDNA，操作步骤根据Takara反转录试剂盒说明书进行，cDNA使用Takara SYBR Premix Ex Taq检测试剂盒检测，HOXA3引物序列： 5′-TGCTTTGTGTTTTGTCGAGACTC-3′，5′-CAACCCTACCCCTGCCAAC-3′，内参引物GAPDH：5′-TATGCTCTCCTCATGCATTG-3′,5′-GGGACGACCTTCGATCTACC-3′。使用2-ΔΔCt表示HOXA3 mRNA的表达。

1.4 HOXA3蛋白表达检测 采用免疫印迹法。细胞经RIPA裂解液裂解后，加入相应体积的Loading buffer，煮沸10 min后，加入到聚丙烯酰胺胶中，浓缩胶80 V，电泳20 min，分离胶100 V电泳40 min，待溴酚蓝跑至胶板底侧时，装配转膜三明治，依次为黑板-滤纸-聚丙烯酰胺胶-活化的PVDF膜-滤纸-白板，湿法转膜1 h后，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入相应一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，并加入HRP耦联的二抗，以GAPDH为内参，使用ECL发光液检测蛋白的表达，蛋白的相对表达量=目的蛋白表达量/GAPDH表达量。

1.5 生存曲线绘制 乳腺癌患者生存曲线数据来源于TCGA公共数据库，以患者基因表达水平的平均值分组，并使用R语言中survival 包进行生存分析，ggplot2包绘制生存曲线。

1.6 细胞迁移数检测 采用Transwell 小室检测细胞迁移能力，Transwell下室加入600 μL完全培养基(DMEM+10%FBS)，上室加入含有1×106细胞的200 μL细胞悬液，14 h后，除去小室上方细胞，下方细胞使用结晶紫染色，显微镜20倍视野下对穿过小室的细胞进行计数，实验重复3次并取平均值。

1.7 细胞增殖能力检测 采用CCK8法，将MCF-7 CON、siRNA2细胞铺于96孔板中，5 000/孔，同时设立复孔，待细胞贴壁后，加入0.1体积的CCK8试剂，避光37 ℃ 孵育 3 h后，使用酶标仪检测OD450，以第0 h的度数为基准，计算24、48、72 h与0 h的比值，即细胞增殖系数。在确定乳腺癌患者HOXA3高表达且与预后相关后，将HOXA3 siRNA转染至人乳腺癌细胞系MCF-7中，48 h后使用QPCR与Western blotting法检测HOXA3 RNA与蛋白表达。

1.8 EMT标记物表达检测 在乳腺癌细胞系MCF-7转染CON(CON组)与HOXA3(HOXA3组)质粒48 h后，使用Western blotting法检测EMT标记物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白。

2 结果

2.1 HOXA3在乳腺癌及癌旁组织中表达比较 HOXA3 mRNA在癌及癌旁组织中的相对表达量分别为17.50±1.44、1.0±0.05，二者比较，P<0.05。HOXA3 蛋白在癌及癌旁组织中的相对表达量分别为13.42±0.18、2.57±0.04，二者比较，P<0.05。

2.2 HOXA3表达与预后间的关系 HOXA3高表达者总体生存率为79.35%、转移生存率为62.38%，HOXA3低表达者总体生存率为89.63%、转移生存率为73.26%，两者比较，P均<0.05。

2.3 HOXA3高表达与乳腺癌细胞系MCF-7迁移和增殖的关系 48 h后CON组、siRNA1组、siRNA2组HOXA3 RNA相对表达量分别为1.0±0.12、0.62±0.01、0.16±0.03，三组比较，P均<0.05。在HOXA3蛋白水平上siRNA1、CON组比较无统计学差异，siRNA2组降低(P<0.05)，因此仅使用siRNA2进行后续实验。siRNA2转染至MCF-7 48 h后，使用Transwell检测迁移的变化，结果显示CON组、siRNA2组迁移细胞数分别为40.57±1.68、18.33±1.01，两组比较，P<0.05；而在转染48 h后使用CCK8检测增殖能力变化，siRNA2组增殖减弱，且在48、72 h时差异均有统计学意义，P均<0.05。

2.4 EMT标记物表达比较 与CON相比，E-cadherin表达升高，Vimentin、N-cadherin、Snail表达均降低，P均<0.05。

3 讨论

乳腺癌的转移能显著降低患者生存率、影响患者预后，而多项研究均表明乳腺癌的转移与EMT密切相关，因此寻找EMT中的关键基因并给予靶向治疗成为研究热点。HOX是一类保守的蛋白，尽管如此，HOX对于EMT的作用已有证实，在神经性胶质瘤中，HOXA13被证实能通过激活wnt与TGF-β通路从而促进EMT的发生和影响患者的预后[11]，以往对乳腺癌中HOX家族的研究包括HOXA3、HOXA9、HOXB5、HOXB9等，其中HOXB5与乳腺癌细胞的EMT特性和侵袭、增殖能力密切相关[12]，HOXA3在结肠癌[13]、胶质瘤[14]及恶性淋巴瘤中[15]已被证实表达增高且与疾病的预后相关，而HOXA3在乳腺癌中表达情况鲜有报道。

在本研究中，首先检测30例乳腺癌患者中癌组织、癌旁组织的HOXA3表达水平，证实了HOXA3在乳腺癌组织中的表达显著升高，随后调取TCGA数据库中乳腺癌患者信息，使用平均值将患者分为HOXA3高表达与低表达组，在对患者总体生存率以及转移率进行生存分析后发现，HOXA3的高表达使得患者总体生存率、转移生存率均降低，初步证实了HOXA3的高表达与患者的预后、转移密切相关。在确定了HOXA3的异常表达后，构建了HOXA3特异性的siRNA，通过QOCR、Western blotting确定HOXA3 siRNA在RNA和蛋白水平的敲低效果，结果表明siRNA2在RNA和蛋白水平均具有更好的敲低效果，因此随后将siRNA2转染至乳腺癌细胞系MCF-7中，48 h后使用Transwell与CCK8检测细胞增殖的变化，结果表明HOXA3的抑制使得MCF-7细胞迁移能力降低、增殖受限，进一步证实了HOXA3对于乳腺癌细胞的迁移、增殖起到重要作用，而随后检测EMT相关标记物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin的变化后发现，E-cadherin表达升高，Snail、N-cadherin、Vimentin表达降低，表明HOXA3对乳腺癌细胞增殖、迁移能力的影响与对EMT的作用相关，Knight等[13]研究结果表明，HOXA3在结肠癌中表达增高，与结肠癌细胞的EMT特性和侵袭、增殖能力密切相关，与本研究结果相似。

综上所述，HOXA3在乳腺癌患者癌组织中高表达，且与患者预后、转移相关，同时HOXA3可减弱乳腺癌细胞迁移、增殖，而这一作用可能与EMT有关。

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