食管癌组织中Cystatin C表达变化及意义

李旭，许荣誉

(福建医科大学附属泉州第一医院，福建泉州 362000)

食管癌组织中Cystatin C表达变化及意义

李旭，许荣誉

(福建医科大学附属泉州第一医院，福建泉州 362000)

目的观察食管癌组织中半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)的表达变化，并探讨其意义。方法食管癌组织及癌旁正常组织各120例份，分别采用免疫组化法、实时荧光定量PCR法检测其Cystatin C，分析Cystatin C表达与食管癌临床病理参数及预后(按照Cystatin C表达水平分为高表达组91例、低表达组29例)的关系。结果食管癌、癌旁组织Cystatin C蛋白阳性表达率分别为75.83%(91/120)、24.17%(29/120)，两组比较，P<0.05；食管癌、癌旁组织Cystatin C mRNA相对表达量分别为1.68±0.24、1.12±0.31，两组比较，P<0.05。Cystatin C表达与食管癌淋巴结转移、远处转移、临床分期有关(P均<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、浸润深度无关(P均>0.05)。高表达组、低表达组术后5年总生存率分别为8.79%(8/91)、34.48%(10/29)，术后生存时间分别为(29.19±2.07)、(45.58±2.96)个月，两组比较，P均<0.05。结论食管癌组织中Cystatin C表达升高，其表达与食管癌淋巴结转移、远处转移、临床分期及患者预后相关；Cystatin C可以作为食管癌患者诊断、预后预测的指标以及治疗的潜在靶点。

食管癌；食管肿瘤；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，居全球六大致死性肿瘤之列[1]。我国是食管癌的高发地区，发病率和病死率均居世界之首[2]。近年来，以手术为主的多学科综合治疗方案取得了巨大进展，但并未显著延长食管癌患者术后生存时间，其5年总体生存率为15%～25%[3,4]。大多数食管癌患者术后死于原位复发或远处转移[5]，寻找能够预测或逆转食管癌侵袭迁移的生物标记物是临床上亟需解决的问题。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂之一，广泛分布于机体组织的有核细胞和体液中，无组织学特异性。组织蛋白酶是一种存在于细胞溶酶体中的半胱氨酸蛋白酶超家族，Cystatin C能够抑制组织蛋白酶的酶活性，阻止其对细胞间质组织和基底膜的破坏作用，从而削弱肿瘤细胞的浸润和迁移能力[6]，Cystatin与组织蛋白酶之间的表达失衡是导致肿瘤向外浸润侵袭和转移的重要因素，与肿瘤患者的不良预后密切相关[7]。目前，有关Cystatin C参与食管癌的恶性生物学行为的报道十分有限。Yan等[8]发现，在食管癌细胞系EC9706中增加Cystatin C表达后，细胞的侵袭能力被显著抑制。本研究观察了Cystatin C的表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2008年6月～2012年6月福建医科大学附属泉州第一医院收治的食管癌患者120例，男74例，女46例；年龄26～79(57.47±13.62)岁，其中<60岁56例，≥60岁64例；肿瘤直径>5 cm 80例，≤5 cm 40例；分化程度：低分化43例，中高分化77例；浸润深度：黏膜下层、黏膜层44例，肌层37例，浆膜层39例；有淋巴转移39例，无淋巴转移81例；有远处转移64例，无远处转移56例；临床分期：Ⅰ期75例，Ⅱ～Ⅳ期45例。纳入标准：术后组织标本均经HE染色明确，病理诊断为食管癌；具有完整的病历资料；均签署知情同意书。排除标准：术前进行放化疗的患者，其他恶性肿瘤患者。手术留取食管癌组织标本及距离癌组织5 cm的癌旁正常组织各120例。本研究经医院伦理委员会审核同意。

1.2 组织中Cystatin C蛋白检测方法 采用免疫组化SP法检测，所有组织样本均经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚切片；经二甲苯脱蜡，在100%、95%、85%的酒精浸泡水化，在98 ℃的枸橼酸钠溶液(pH 6.0)中浸泡15 min进行抗原修复，为降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育10～15 min，滴加正常山羊血清室温封闭20 min，弃去血清，分别滴加Cystatin C一抗工作液(ab109508，美国Abcam公司，稀释比1∶150)，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤3×5 min，滴加生物素二抗(上海合星生物科技有限公司，稀释比1∶200)，室温孵育30 min，PBS洗涤3×5 min，DAB显色(武汉博士德生物工程有限公司)，充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。以PBS替代一抗作阴性对照。随机选取10个含有阳性细胞的10倍视野进行观察。阳性细胞所占比例：无阳性细胞为0分，≤25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分；染色程度：无阳性着色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分；按阳性细胞所占比例和染色程度综合判定，二者之和>3分为阳性表达，≤3分为阴性表达。

1.3 组织中Cystatin C mRNA检测方法 采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR法)。TRIzol法提取组织总RNA(美国Invitrogen公司)，按照RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)的说明书操作。紫外分光光度计(美国Thermo公司)检测总RNA浓度及纯度，逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)进行逆转录，cDNA产物置于-20 ℃保存备用。qRT-PCR引物序列(南京金斯瑞生物科技公司)如下，Cystatin C正向引物：5′-TCCAGTCCCGGCAAGCCGCCGC-3′，反向引物5′-CTAGGCGTCCTGACAGGTGGATTTC-3′；GAPDH正向引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反向引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。定量PCR扩增仪(ABI 7500，美国ABI公司)检测Cystatin C。qRT-PCR扩增体系为10 μL，反应条件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，进行35个循环。用2-ΔΔCt方法表示Cystatin C mRNA相对表达量。

1.4 患者预后随访 采用电话或者门诊的方式进行随访，随访时间为手术后1～60个月，直至患者死亡或者随访时间截止。

2 结果

2.1 食管癌、癌旁组织Cystatin C表达比较 免疫组化检测显示，食管癌、癌旁组织Cystatin C蛋白阳性表达率分别为75.83%(91/120)、24.17%(29/120)，两组比较，P<0.05；食管癌、癌旁组织Cystatin C mRNA相对表达量分别为1.68±0.24、1.12±0.31，两组比较，P<0.05。

2.2 Cystatin C表达与食管癌临床病理参数的关系 结果见表1。由表1可知，Cystatin C表达与食管癌淋巴结转移、远处转移、临床分期有关(P均<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、浸润深度无关(P均>0.05)。

表1 Cystatin C表达与食管癌临床病理参数的关系

2.3 Cystatin C表达与食管癌患者预后的关系 将120例食管癌患者按照Cystatin C表达水平分为高表达组(癌组织中Cystatin C蛋白染色强度大于对应的癌旁正常组织，91例)、低表达组(癌组织中Cystatin C蛋白染色强度小于对应的癌旁正常组织，29例)，绘制Kaplan-Meier生存曲线，结果显示高表达组、低表达组术后5年总生存率分别为8.79%(8/91)、34.48%(10/29)，术后生存时间分别为(29.19±2.07)、(45.58±2.96)个月，两组比较，P均<0.05。

3 讨论

食管癌是一种致死率极高的恶性肿瘤，全球每年新发病例约48万[2]。食管癌早期患者的术后5年总生存率高达70%[9]，然而大多数患者在确诊时已处于中晚期，对周围组织的浸润侵袭和淋巴结转移是导致食管癌患者预后不良的主要原因[10]。食管癌具有明显家族聚集性和地域性，提示食管癌的发生发展与环境因素、遗传因素密切相关，然而其确切的发生发展机制并未完全阐明。

Cystatin C由CST3基因编码，分子量约13 kD，是一种非糖化的碱性蛋白质，临床上被广泛用于评价肾小球滤过功能[11]。Cystatin C在人体各种生理和病理过程发挥重要作用，当基因突变发生后，会引发遗传性Cystatin C淀粉样血管病，进而导致脑出血等疾病，这是近年来临床发现的与Cystatin C直接相关的疾病，Cystatin C在心血管系统疾病的研究已取得了巨大成果[12]。Cystatin C与肿瘤之间的关系已成为近年研究的热点，近年研究[13]显示，Cystatin C作为组织蛋白酶抑制剂，与组织蛋白酶相互作用，共同参与肿瘤的发生和恶性进展过程。Gursoy等[14]发现，卵巢肿瘤组织中Cystatin C水平明显高于良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织。Zhang等[15]也发现，在结直肠癌患者血清中，Cystatin C处于高表达状态。李静等[16]发现，Cystatin C处理乳腺癌MCF-7细胞，导致细胞增殖能力下降。然而，Wegiel等[17]则发现，前列腺癌组织中Cystatin C表达水平低于前列腺良性肿瘤组织。

本研究显示，食管癌组织Cystatin C蛋白、mRNA表达均高于癌旁正常组织，此结果与Zeng等[18]的检测结果一致，提示Cystatin C与食管癌发生机制密切相关，可以作为诊断食管癌的有效指标之一。本研究发现，Cystatin C表达与食管癌淋巴转移、远处转移及临床分期密切相关，且Cystatin C表达水平越高，预示着可能已经发生了淋巴转移、远处转移以及处于肿瘤中晚期，提示Cystatin C参与并且促进了食管癌恶性进展，此结果与Kume等[19]在食管癌中的研究结果一致，Cystatin C可以作为食管癌患者不良预后的指标。而何琳莉等[20]发现，在食管癌组织中Cystatin C表达阳性率低于癌旁正常组织，并且Cystatin C表达水平并不影响食管癌患者的5年生存率，与患者预后无关。本研究认为，恶性肿瘤组织中Cystatin C表达升高，可能是由于机体反馈调节机制的作用，随着肿瘤的恶性进展，肿瘤组织中组织蛋白酶表达增加，活性增强，反馈性地引起Cystatin C表达的增加。进一步分析发现，Cystatin C表达水平对食管癌患者术后生存时间的影响，Kaplan-Meier生存曲线结果显示，Cystatin C高表达食管癌患者的术后5年总生存率仅为8.79%，且Cystatin C高表达食管癌患者的术后生存时间显著低于Cystatin C低表达的食管癌患者，上述结果提示Cystatin C高表达与食管癌患者预后不良密切相关。而Cystatin C通过哪些途径导致食管癌恶性进展以及不良预后，仍有待于进一步的探索研究。再者，由于本研究的实验样本数有限，为了得到更可靠的结论，仍然需要扩大样本量进行深入验证。

总之，Cystatin C在食管癌组织中发挥促癌基因的功能，促进食管癌的发生和恶性发展，且Cystatin C表达越高，患者预后越差。Cystatin C有可能作为食管癌患者预后预测及治疗的潜在靶点。

[1] Pennathur A, Gibson MK, Jobe BA, et al. Oesophageal carcinoma[J]. Lancet, 2013,381(9864):400-412.

[2] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[3] Kumagai K, Rouvelas I, Tsai JA, et al. Survival benefit and additional value of preoperative chemoradiotherapy in resectable gastric and gastro-oesophageal junction cancer: a direct and adjusted indirect comparison meta-analysis[J]. Eur J Surg Oncol, 2015,41(3):282-294.

[4] 周国志,朱斌,吕进,等.食管癌术后并发症及其处理[J].现代生物医学进展,2014,14(11):2183-2186.

[5] Iams WT, Villaflor VM. Neoadjuvant treatment for locally invasive esophageal cancer[J]. World J Surg, 2017,41(7):1719-1725.

[6] Zhang J, He P, Zhong Q, et al. Increasing Cystatin C and Cathepsin B in serum of colorectal cancer patients[J]. Clin Lab, 2017,63(2):365-371.

[7] Tustumi F, Kimura CM, Takeda FR, et al. Prognostic factors and survival analysis in esophageal carcinoma[J].Arq Bras Cir Dig, 2016,29(3):138-141.

[8] Yan Y, Zhou K, Wang L, et al. Expression of cystatin C and its effect on EC9706 cells in esophageal carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(9):10102-10111.

[9] Torrance AD, Almond LM, Fry J, et al. Has integrated 18F FDG PET/CT improved staging, reduced early recurrence or increased survival in oesophageal cancer[J]. Surgeon, 2015,13(1):19-33.

[10] Wang N, Jia Y, Wang J, et al. Prognostic significance of lymph node ratio in esophageal cancer[J]. Tumour Biol, 2015,36(4):2335-2341.

[11] Papassotiriou GP, Kastritis E, Gkotzamanidou M, et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin and Cystatin C are sensitive markers of renal injury in patients with multiple myeloma[J]. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2016,16(1):29-35.

[12] Zhang J, He P, Zhong Q, et al. Increasing Cystatin C and Cathepsin B in serum of colorectal cancer patients[J]. Clin Lab, 2017,63(2):365-371.

[13] Guo S, Xue Y, He Q, et al. Preoperative serum cystatin-C as a potential biomarker for prognosis of renal cell carcinoma[J]. PLoS One, 2017,12(6):e0178823.

[14] Gursoy AY, Pabuccu EG, Kiseli M, et al. Is cystatin C level altered in women with polycystic ovary syndrome[J]. Clin Chem Lab Med, 2016,54(9):e265-e267.

[15] Zhang J, He P, Zhong Q, et al. Increasing Cystatin C and Cathepsin B in serum of colorectal cancer patients[J]. Clin Lab, 2017,63(2):365-371.

[16] 李静,周伟强.组织蛋白酶B在SAHA诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡过程中的调控作用[J].中国药理学通报,2016,32(8):1086-1090.

[17] Wegiel B, Jiborn T, Abrahamson M, et al. Cystatin C is downregulated in prostate cancer and modulates invasion of prostate cancer cells via MAPK/Erk and androgen receptor pathways[J]. PLoS One, 2009,4(11):e7953.

[18] Zeng Q, Zhao Y, Yang Y, et al. Expression of cystatin C in human esophageal cancer[J]. Tumori, 2011,97(2):203-210.

[19] Kume M, Yasui H, Yoshikawa Y, et al. Transient elevation of serum cystatin C concentrations during perioperative cisplatin-based chemotherapy in esophageal cancer patients[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2012,69(6):1537-1544.

[20] 何琳莉,高驰丹,文彬,等.Cathepsin B与Cystatin C在食管癌中的表达及意义[J].广东医学,2017,38(9):1402-1405.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.018

R735.1

B

1002-266X(2017)47-0060-04

泉州市科技计划项目(2012Z6)。

2017-07-18)