贵州地区575例男性不育症患者染色体核型分析及Y染色体AZF微缺失情况观察

陈琨,廖喆,任凌雁,聂瑛洁

(1贵州省人民医院，贵阳550003；2贵阳市第四人民医院)

·临床研究·

贵州地区575例男性不育症患者染色体核型分析及Y染色体AZF微缺失情况观察

陈琨1,廖喆2,任凌雁1,聂瑛洁1

(1贵州省人民医院，贵阳550003；2贵阳市第四人民医院)

目的观察贵州地区男性不育症患者染色体核型异常、Y染色体精子生成基因(AZF)微缺失情况。方法贵州地区男性不育症患者575例，采用染色体G显带操作技术进行染色体核型分析，PCR与琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量PCR检测Y染色体AZF的相关序列标签位点。结果575例不育症患者中，染色体核型异常率为10.6%(61/575)，最常见类型为47,XXY、占80.33%(49/61)。Y染色体AZF微缺失发生率为7.13%(41/575)，最常见类型为仅AZFc缺失、占43.34%(19/41)。结论贵州地区男性不育症患者染色体核型异常及Y染色体AZF微缺失发生率较高，染色体核型及Y染色体AZF微缺失联合检测有助于男性不育症原因的发现，也有助于本病的诊断及治疗。

不育症；染色体核型；Y染色体；精子生成基因

造成男性不育的原因很多。由精索静脉曲张、隐睾、生殖系统感染、内分泌紊乱、免疫反应异常等原因造成的男性不育可以通过手术治疗或药物治疗的方式解决。但由遗传缺陷引起的精子发生障碍，则药物治疗效果差。Klinefelter综合征由Klinefelter等于1942年首次描述并记载，又称先天性曲细精管发育不全，是一种性染色体异常疾病，男性发病率为0.1%～0.2%，在男性不育症患者中占3.1%，是引起原发性睾丸功能减退最常见的先天性疾病，也是最常见的原发性性腺功能减退[1～3]。Y 染色体长臂上存在与精子发生相关的基因，即Y染色体上的精子生成基因(AZF)。在无精子症和严重少精子症的患者中AZF微缺失率占8.2%[4～6]。本研究对贵州地区男性不育症患者染色体核型异常、Y染色体AZF微缺失情况进行了观察。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年1月～2015年9月就诊于贵州省人民医院的男性原发性不育症患者575例，年龄18～55岁，籍贯均为贵州。按照WHO精液分析标准：3次检查精子密度，且精液离心后也未能发现精子为无精；精子密度≤ 15×106/mL为少精。患者均知情同意参与本研究。

1.2 染色体核型分析 2.5 mL无菌注射器抽取患者全血2 mL，立刻加入0.5 mL配置好的肝素溶液备用(使用无菌生理盐水调整肝素浓度为500 U/mL)。取肝素抗凝血0.8～1.2 mL，在淋巴细胞培养基中悬浮培养3 d。按照染色体G显带操作技术，制片后进行染色体核型分析。染色体正常核型为(46，XX/46，XY)。

1.3 Y染色体AZF微缺失检测 使用EDTA抗凝管抽取患者全血2 mL。 ①PCR与琼脂糖凝胶电泳检测Y染色体控制精子生成基因(AZF)的15个序列标签位点(STS)：随机挑选300例受检对象，使用DNA提取试剂盒提取全血细胞的DNA。按照亚能生物技术公司AZF微缺失检测试剂盒说明书操作。PCR(聚合酶链反应)扩增AZF的15个STS：AZFa为SY82、SY84、SY86 ；AZFb 为SY124、SY127、SY128、SY133、SY134、SY143 ；AZFc 为SY152、SY239、SY242、SY254、SY255 ；AZFb+c为SY145。阳性对照为已经确定Y染色体AZF各区段无缺失的正常男性，阴性对照为正常女性，一对扩增SRY(位于Y染色体短臂上的性别决定基因)的引物作为内控。PCR 产物10 μL经4.0%琼脂糖凝胶电泳100 V/40 min，用凝胶成像系统进行DNA 电泳条带的观察。②实时荧光定量PCR检测AZF的6个STS：275例受检对象，使用DNA提取试剂盒提取全血细胞的DNA。按照上海透景生命科技有限公司AZF检测试剂盒说明书操作。用多重 PCR技术快速检测Y染色体AZF基因家族AZFa、AZFb、AZFc三个区域中的6个序列标签位点：AZFa为SY84、SY86 ；AZFb 为SY127、SY134；AZFc 为SY254、SY255。每个样品需做A组和B组两个多重PCR反应，A组包括sY254、sY127、sY86三个位点，B组包括sY134、sY84、sY255三个位点。另外，每组设置一对扩增SRY基因的引物作为内对照。通过扩增曲线直接观察结果。根据2003欧洲男科学协会Y 染色体AZF微缺失分子诊断指南,推荐AZF检测应至少包含以下STS引物：AZFa: sY84,sY86; AZFb: sY127,sY134; AZFc: sY254,sY255。STS能够扩增出来说明该区域序列未发生缺失。

2 结果

2.1 染色体核型异常情况 575例男性不育症患者中，染色体核型异常61例，染色体核型分析异常率为10.61%(61/575)；其中最常见的异常类型为47，XXY，共49例，占80.33%(49/61)；其他异常核型包括1例48，XXXY、1例46，XXY,rob(13;14)(q10;q10)、性反转3例46，XX、Y染色体部分缺失4例46,XY,del(Y)(q11.23)、Y染色体倒位3例46，XY，inv(Y)。

2.2 Y染色体AZF微缺失情况 575例患者中，Y染色体AZF缺失41例，缺失率为7.13%(41/575)；其中仅AZFa缺失3例，仅AZFb缺失2例，仅AZFc缺失19例，AZFa及AZFb复合缺失1例，AZFb及AZFc复合缺失11例，全部缺失5例。

3 讨论

有关Y染色体微缺失遗传型与表型的关系已进行了大量研究，对临床有非常好的指导作用。AZFa、AZFb和AZFc三个区域全部缺失的患者，100%表现为无精子症，通过任何手段都不可能从睾丸中获得精子。AZFa区域整段缺失通常导致唯支持细胞综合征(SCO综合征)，临床表现为无精子症[7]。如果诊断为整段AZFa区域缺失，若想从睾丸中获得精子进行卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI )已不大可能。AZFb和AZFb+c整段缺失的典型睾丸组织学特征是SCO综合征或生精阻滞。与AZFa区域整段缺失的情况类似，此类患者在睾丸穿刺时也找不到精子，因此不推荐给这类患者施行ICSI。AZFc缺失的临床和睾丸组织学表型多种多样，通常AZFc缺失患者尚残存精子生成能力，AZFc缺失见于无精子症或严重少精子症患者，罕见情况下，也可以在自然状态下遗传给其男性后代(由于该基因位于Y染色体上，通常情况下患者不能生育，但也有罕见情况，即患者发生自然生育，这样患者会将该基因缺失遗传给其男性后代，其男性后代也会发生无精症或者严重少精症)。在无精子症患者中，AZFc缺失者通过睾丸取精术获得精子的机会要大得多，也可以进行ICSI助孕。但这些患者的男性子代将是AZFc缺失的携带者。另外，有研究[8～12]发现，AZFc区域缺失的少精子症患者，其精子数目有进行性下降的趋势，最后发展为无精子症。因此，对AZFc区域缺失的少精子症患者，应及早进行治疗或将其精液进行冷冻保存。Klinefelter综合征临床表现为睾丸小而硬、不育或生精障碍、男性乳房发育、身材过高和骨骼比例失常(类睾丸消失综合症)、高促性腺激素血症及多X染色体核型。但由于该综合征临床表现的变化较大，临床医生缺乏足够和非常专业的知识，许多患者未被诊断，或者诊断的很晚。而早期诊断和雄激素补充治疗，能改善患者生活质量、预防严重后果。通过辅助生殖技术(ART)，结合睾丸活检，可以使部分患者生育健康后代，但为了防止染色体异常疾病下传给患者后代，必须加强辅助生殖植入前和出生前的遗传学诊断。及时进行Y染色体AZF微缺失检测及染色体核型分析对不育症的诊断及治疗具有非常重要的意义，及早的诊断可以避免不必要的手术及药物治疗；同时对有可能生育的患者选择确实可行的方法治疗或ART，完成患者生殖愿望。

不同地区或实验室报道的不育症患者染色体核型异常类型及Y染色体AZF微缺失率差别较大。本研究发现贵州地区男性不育症患者染色体核型异常率为10.6%，最常见的异常类型为47，XXY(占80.33%)；Y染色体AZF微缺失率为7.13%，最常见类型为仅AZFc缺失(占43.34%)。这一结果提示染色体核型异常及Y染色体AZF微缺失在贵州地区男性不育症患者中的发生率均较高，对染色体核型及Y染色体AZF微缺失进行联合检测将有助于男性不育症原因的发现，也有助于本病的诊断及治疗。

[1] Thomas NS, Collins AR, Hassold TJ, et al. A reinvestigation of non-disjunction resulting in 47, XXY males of paternal origin[J]. Eur J Hum Genet, 2000,8(10):805-808.

[2] 黄锦，廉颖，刘平．Klinefelter综合征患者胚胎着床前遗传学诊断的临床应用[J]．中国优生与遗传杂志，2010，18(3)：52．

[3] Vernaeve V, Staessen C, Verheyen G, et al． Can biological or clinical parameters predict testicular sperm recovery in 47, XXY klinefelter′s syndrome patients [J] . Ham Reprod, 2004,19(5)：135-1139.

[4] 丁显平，钟影，魏霞．等.成都地区男性原发性无精症患者Y染色体AZF区域微缺失基因诊断的研究[J]．国外医学·临床生物化学与检验学分册，2005，26(8)：498-502．

[5] 李鹏丽，李娇，马云霞，等．150例无精子和少精子症患者Y染色体AZF区微缺失检测及染色体核型分析[J]．中国优生与遗传杂志，2014，22(7)：30-32．

[6] 万凌，丁显平．165例男性不育染色体核型及AZF基因缺失分析[J]．中国优生与遗传杂志，2014，22(9)：55-56．

[7] 邵法明，朱晓斌，李铮．男性不育症ICSI治疗的遗传风险分析[J]．中华男科学杂志，2008，14(1)：71-74．

[8] 吴青，王会，刘玉林，等．中国汉族人群AZFc微缺失区域序列标签位点的探讨[J]．中华男科学杂志，2011，17(5)：391-395．

[9] Han XY, Jin L, Fan GS, et al. Fetal anomalies in second trimester in recent ten years: clinical analysis of 116 cases[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2009,89(15):1053-1056.

[10] Anderson CL, Brown CE. Fetal chromosomal abnormalities: antenatal screening and diagnosis[J]. Am Fam Physician, 2009,79(2):117-123.

[11] Ambulkar PS, Sigh R, Reddy M, et al. Genetic risk of azoospermia factor (AZF) microdeletions in idiopathic cases of azoospermia and oligozoospermia in central Indian population[J]. J Clin Diagn Res, 2014,8(3):88-91.

[12] Vijesh VV, Nambiar V, Mohammed SI, et al. Screening for AZFc partial deletions in Dravidian men with nonobstructive azoospermia and oligozoospermia[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2015,19(3):150-155.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.012

R698.2

B

1002-266X(2017)47-0042-03

贵州省科学技术基金资助项目(2015-7168，2015-4015，2015-7169)。

聂瑛洁(E-mail： 744565742@qq.com)

2017-08-09)