直接扩增法用于重大灾难事故中软骨的个体识别

王传海，徐程，李湘秦，吴勇，杜舟

（深圳市公安局刑事警察支队刑事技术处，广东深圳 518040）

直接扩增法用于重大灾难事故中软骨的个体识别

王传海，徐程，李湘秦，吴勇，杜舟

（深圳市公安局刑事警察支队刑事技术处，广东深圳 518040）

目的探讨直接扩增法对软骨STR检验的有效性，以提高灾难受害者身源鉴定工作效率。方法采用PowerPlex®21试剂盒对88份软骨进行直接扩增法检验，同步进行磁珠法比较分型结果。结果88份软骨检材中，直接扩增法与磁珠法均成功检出84份检材的STR基因型，两者分型结果完全一致。结论PowerPlex®21试剂盒直接扩增法可以应用于软骨STR分型检验，且操作简便、快速，在重大灾难事故身源鉴定中具有很好的应用前景。

法医遗传学；软骨；基因分型技术；直接扩增法；个体识别

在重大灾难事故中，遇难者身份识别工作非常重要，不仅可以有效地指导救援及善后处理工作，而且关系到社会的稳定，如何快速、准确地进行身份识别就显得尤为重要。DNA技术是身份识别工作中最核心的环节。软骨与血液、软组织等相比不易腐败，同时比骨骼、牙齿更易于处理，因此成为腐败尸体STR检验的首选检材。国内很早就有关于软骨DNA STR检验的研究[1]和通过检测肋软骨DNA含量推断死亡时间（PMI）的研究[2]。直接扩增法因其操作简便、快速，目前已广泛应用于血痕[3，4]、口腔拭子等检材的案件检验[5]以及DNA数据库建设[6]中，将其应用于软骨样本的相关报道较为少见。为加快灾难受害者身源鉴定，本研究对“2015.12.20深圳山体滑坡事故”中的88份软骨采用直接扩增法，并同步与磁珠法检验结果进行比较研究，以验证软骨直接扩增法在灾难受害者身源鉴定中的可行性。

1 材料与方法

1.1 样本

样本来自“2015.12.20深圳山体滑坡事故”中遇难者遗骸，死亡时间在4～30d，其中肋软骨61份，关节面软骨27份，共计88份，所取软骨呈不同程度的腐败。

1.2 主要仪器和试剂

9700型PCR扩增仪、3500XL型遗传分析仪（美国AB公司），KingFisher Due Prime微量生物物证DNA自动化提取纯化系统（美国Thermo Scientific公司）。

PowerPlex®21试剂盒（美国Promega公司），ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒（长春博坤生物科技有限公司）。

1.3 取样及DNA提取

直接扩增法：88份软骨检材去除肌肉等软组织后，用刀片在软骨中部内侧切取2mm×2mm大小、约0.5mm厚的软骨薄片，置于0.2mL的扩增管底部。

磁珠法：88份软骨检材去除肌肉等软组织后，用刀片在软骨中部内侧切取10mm×5mm大小、约0.5mm厚的软骨薄片，置于1.5mL的离心管中。加入消化液ML 360μL，10mg/mL的PK 30μL，DTT 10μL，56℃振荡孵育1h。孵育后涡旋振荡混匀，以离心半径8cm，12 000 r/min，离心3 min。将离心后的消化产物转移到ML-超微量磁珠法DNA提取试剂反应板中，在KingFisher Due Prime平台上提取DNA，用40 μL高纯水洗脱回收纯化后的DNA。

1.4 扩增及电泳

直接扩增法：选用PowerPlex®21试剂盒，扩增体系为Master Mix 2 μL、Primer Mix 2 μL、H2O 6 μL。直接加入扩增管中，使软骨完全浸泡在试剂中。

磁珠法：扩增体系为10μL，取提取的DNA 1 μL作为模版，加入Master Mix 2 μL、Primer Mix 2 μL、H2O 5μL在同一扩增管中。

扩增参数：96℃热启动1 min；94℃10 s，59℃1min，72℃30s，29个循环；60℃20min；4℃保存备用。

同时选取PowerPlex®21试剂盒中2800为阳性对照，纯水作为阴性对照进行扩增。

电泳：取扩增产物1μL，加入10 μL甲酰胺和内标的混合物（1 000∶70），在3500XL型遗传分析仪上进行毛细管电泳检测分型。相对荧光信号单位值（relative fluorescence units，RFU）≥150为检出成功。

2 结果

直接扩增法检验的88份软骨样本中，4份未检出STR分型，其余84份均得到完整的分型图谱，检出的成功率为95.45%，各基因座之间峰高均衡性好，同一基因座等位基因峰高差小于30%，峰宽小于1.5bp。

磁珠法检验的结果和直接扩增法完全一致，同一检材采用两种方法得到的STR分型结果一致，未见等位基因丢失、多带等现象。直接扩增法检验未得到STR分型的4份检材，采用磁珠法提取DNA后扩增检验仍无法得到STR分型。

3 讨论

重大灾难事故的现场通常环境特殊，遇难者人数多，且遗骸受到严重的损毁，大部分不具备直接辨认条件。对于尸源的认定，依靠随身物品、尸检记录或者医疗记录等方式具有很大的局限性，结果往往不可靠。DNA具有个体组织同一性，同一个体不同组织的STR分型完全相同[7]，因此，只要提取到足够的DNA用于STR检验，可以不受组织来源、形态特征的限制，有效地将遇难者各部分残缺遗骸相互关联起来，实现同一认定。目前，利用DNA技术进行灾难受害者身源鉴定已成为重大灾难事故处置中最为科学、准确、高效的首选方法。为了及时将遇难者遗骸归还家属、稳定社会以及妥善安排善后工作，DNA检验应在最短的时间内进行身份识别，确定死亡人员及死亡人数。

重大灾难事故现场处置时间一般较长，加上环境特殊，因此，易于腐败的血液、软组织等往往难以适用于后续的检验，而软骨、骨、牙齿具有较强的抗腐蚀能力，多为灾难受害者身源鉴定中DNA提取的主要检材。但骨和牙齿的提取实验时间较长，需要近2d的时间[8]，操作过程复杂。软骨是特异化的致密结缔组织，细胞间质坚固而有弹性，DNA提取相对更为快速、便捷。成年人软骨主要存在于骨的关节面、肋软骨、气管、耳廓、椎间盘等处。目前软骨DNA的提取多采用Chelex-100法、有机法、磁珠法、硅珠法等[9，10]，这些方法都需要对软骨组织进行前期处理、DNA裂解、提取以及纯化等，直接扩增法省略了这些步骤，有效地节约了检验所需的时间，同时减少了潜在污染的发生。

本研究用PowerPlex®21试剂盒直接扩增软骨检材的DNA，获取STR分型结果。技术上影响分型结果的因素主要有以下几点：（1）检材剪取时软骨切片的大小和厚度决定了DNA分子的释放；（2）软骨中DNA的含量受个体因素和腐败程度的影响，不同个体软骨中DNA含量有所不同；（3）检材中扩增抑制剂的含量影响扩增的效果，抑制剂的来源包括机体腐败产生的抑制剂和泥土中含有的腐殖质等。为了提高检验成功率，实验中应注意：（1）为增加DNA的释放量，软骨切片大小适中，切片厚度应小于0.5mm；（2）根据检材情况，对严重腐败的检材适当增加取材量；（3）为减少抑制剂的影响，取材时尽量选取中间部位，此外还可选择25μL扩增体系降低抑制剂的浓度。

“2015.12.20深圳滑坡事故”发生于工业园区，遇难者多为外来务工人员，长期离家打工暂居于工厂宿舍中，个人生前物品在灾难发生后被毁，个体身源认定主要依靠与家属之间的亲缘比对。三联体亲权鉴定至少要检测15个STR基因座；单亲亲权鉴定如果检测至18个STR基因座且没有矛盾基因座出现，可以得出“不排除亲生关系”的结论[11]。有研究采用Identifiler Direct PCR[12]、PowerPlex®16 HS[13]试剂盒对肋软骨进行直接扩增法检验，两种试剂盒检验的STR基因座均为15个，扩增得到的STR等位基因较少，因本次事故遇难者身源鉴定中，涉及45个三联体亲缘鉴定和13个二联体亲缘鉴定，故上述两个试剂盒在本次事故中难以得出可靠的结论。采用的PowerPlex®21体系含有20个常染色体STR和性别基因座，相比之下增加了5个基因座，其中包含D2S1338、Penta E和在中国人群中有很好多态性的D6S1043[14]，三者个体识别率分别为0.959、0.984和0.942[15]，大大提高了亲权指数及亲缘认定的可信度。

同时，Identifiler Direct PCR[12]、PowerPlex®16 HS[13]试剂盒直接扩增时间需要2.5 h以上，PowerPlex®21试剂盒所需的扩增时间为1.5h左右，大大缩短了DNA检验所需的时间。

死后变化的影响因素不仅包括自然环境（温度、湿度、空气等），还与尸体本身的因素（年龄、性别、体型等）相关。本研究中，共有2份肋软骨和2份关节面软骨采用两种方法均未检出死者的STR分型，后期通过骨骼检验，确认其中3份为儿童样本。儿童、婴幼儿由于其体内水分比例较成年人高，故死后变化发展较快[16]，软骨腐败程度较成年人高，难以检出。另外1例未检出样本为此次事故中最晚发现的遇难者，取材距离事故发生已有30d，软骨组织腐败严重，关节面软骨腐败致切片浑浊且无韧性。有研究[17]表明，大鼠死后28d，肋软骨细胞核完全崩解，对肋软骨进行STR分型检验具有很大的难度，此后对死者身源的鉴定，软骨组织已经不再适用，骨骼和牙齿的检验结果更为可靠。

综上所述，本研究验证了PowerPlex®21体系直接扩增法对软骨扩增的有效性，该方法操作简便、快速，在重大灾难事故身源鉴定中具有很好的应用前景。

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Individual Identification of Cartilage by Direct Amplification in Mass Disasters

WANG Chuan-hai,XU Cheng,LI Xiang-qin,WU Yong,DU Zhou
（Criminal Technology Division,Criminal Police Detachment,Shenzhen Public Security Bureau,Shenzhen 518040,China）

ObjectiveTo explore the effectiveness of direct amplification for the STR analysis of cartilage,and to accelerate the effectiveness of disaster victim identification.MethodsEighty-eight cartilage samples were directly amplified by PowerPlex®21 kit,and the results of genotyping were compared with that obtained by the magnetic beads method.ResultsIn 88 cartilage samples,the STR genotypes were successfully detected from 84 samples by direct amplification and magnetic beads method,and both the results of genotyping by two method were consistent.ConclusionDirect amplification with Power-Plex®21 kit can be used for STR genotyping of cartilages.This method is operated easily and promptly, which has a potential application in the individual identification of mass disasters.

forensic genetics;cartilage;genotyping techniques;direct amplification;individual identification

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.014

1004-5619（2017）03-0281-03

2016-02-23）

（本文编辑：柳燕）

王传海（1973—），男，硕士，副主任法医师，主要从事法医DNA检验和鉴定；E-mail：boatseawang＠126.com

徐程，女，硕士，主要从事法医DNA检验和鉴定；E-mail：xucheng19891020＠aliyun.com