DNA甲基化检测方法及其法医学应用研究进展

聂燕钗，俞丽娟，管桦，赵颖，荣海博，姜伯玮，张涛

（公安部第一研究所，北京 100022）

DNA甲基化检测方法及其法医学应用研究进展

聂燕钗，俞丽娟，管桦，赵颖，荣海博，姜伯玮，张涛

（公安部第一研究所，北京 100022）

DNA甲基化是表观遗传标记的重要组成部分，参与基因表达的调控，在生物发育、衰老以及肿瘤学等领域受到广泛关注。由于具有相对稳定性、可遗传、含量丰富、随龄变化等特点，在法医学领域，DNA甲基化可以作为DNA序列相关经典遗传标记的有效补充，用于年龄推断、组织体液来源检测、同卵双生子的鉴定等。DNA甲基化的检测方法主要有基于甲基化敏感限制性内切酶、重亚硫酸盐转化以及甲基化CpG结合蛋白等原理而建立的一系列方法，近年研究表明，第三代测序技术也可用于DNA甲基化检测。本文就DNA甲基化检测方法及在法医学领域的应用研究进行回顾与综述，以期为法医学实践提供参考。

法医遗传学；DNA甲基化；综述；双生，单卵；三代测序

表观遗传学（epigenetics）是研究DNA序列不变的情况下，基因表达发生可遗传变化的一门遗传学分支学科[1]，主要包括DNA甲基化、染色质重组、组蛋白修饰等，与印记基因形成、基因沉默、X染色体失活、胚胎发育（干细胞分化）及肿瘤发生等密切相关。其中，DNA甲基化是表观遗传学重要的遗传修饰形式，是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine，SAM）为甲基供体，将甲基添加到CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）。在人基因组中，约有3×107个CpG位点，据估计，约60%～90%的CpG处于甲基化状态，而处于去甲基化状态的CpG大都成簇出现，被称为CpG岛，位于基因启动子区，参与基因表达的调控[2]。一般认为，DNA甲基化对基因的表达是抑制的。本研究根据近年来对DNA甲基化的研究成果，对人类DNA甲基化的特点、检测方法的进展以及在法医学领域的应用进行综述。

1 DNA甲基化的特点

1.1 多态性标记

一般认为，DNA甲基化在基因组中有两种存在形式，即甲基化和去甲基化，表现出类似SNP“二等位基因”的状态（二态性）。然而与SNP的“二态性”所不同的是，同一CpG位点的甲基化状态在不同组织、不同细胞间有可能不同，因此将DNA甲基化分为低甲基化、中等程度甲基化和高甲基化三种状态。新近有研究表明，甲基化的CpG在去甲基化过程中会产生中间产物5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）、5-甲酰基脱氧胞嘧啶（5-formyldeoxycytydine，5-fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxydeoxycytidine，5caC）[3，4]，其中，5-hmC被称为“第六种碱基”[5]。假使5-hmC在基因组中含量丰富，且有成熟的检测方法，那么检测DNA甲基化所获得的多态性信息量则更为丰富。

1.2 随龄变化

DNA甲基化与年龄之间存在一定的相关性。有研究证明，随着年龄的增长，人类总体DNA甲基化水平下降[6，7]，在细胞分化的过程中，DNA保持甲基化的能力降低[8]。然而也有研究[9，10]表明，在基因组整体甲基化水平降低的同时，也伴有一些基因甲基化水平增高的现象，比如在中枢组织中DNA甲基化水平随着年龄的增长而上升。

1.3 组织特异性

胚胎细胞中基因调控区的CpG岛区域不存在甲基化，在个体发育过程中逐步形成相应的甲基化模式，用以调控基因的差异化表达。全基因组研究发现，在染色体的特定位置上存在组织特异性差异甲基化区域（tissue-specific differentially methylated regions，tDMR），在不同细胞核组织中表现出不同的甲基化模式[11-13]。

1.4 亲源特异性

DNA甲基化作为一种共价标记，参与印迹基因的形成。所谓印迹基因是指一方亲本来源的同源基因表达，而另一方不表达。人类是二倍体，基因拷贝一个来自父亲，一个来自母亲。大多数情况下两个等位基因是同等表达。但对于少部分基因，在父亲或母亲传递给子代时发生了DNA甲基化修饰，由此造成了一方基因表达沉默，两个等位基因表现出亲源依赖性的表达特性[14]。

2 DNA甲基化的检测方法

根据检测目的的不同，DNA甲基化的检测方法可以分为针对单个位点和整个基因组的甲基化扫描。根据检测原理的不同，可以分为四类：（1）对未甲基化的胞嘧啶进行化学修饰；（2）利用甲基化敏感限制性内切酶（methylation sensitive restriction enzymes，MSRE）进行检测；（3）利用甲基化CpG结合蛋白（methyl-CpG-binding protein，MeCP）进行分析；（4）利用单分子测序（single-molecule sequencing，SMS）方法直接检测。

2.1 对未甲基化的胞嘧啶进行化学修饰

对未甲基化的胞嘧啶进行化学修饰，将表观遗传信息的差异转换成DNA序列的差异。用重亚硫酸盐对DNA进行处理，可以将未甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，而甲基化的胞嘧啶不发生转变[15]。在随后的PCR过程中，尿嘧啶U被转化成为胸腺嘧啶T。转化后的片段通常可以结合一代测序技术（双脱氧核苷酸法），用于单个位点或者特定片段的DNA甲基化检测。

同时，该方法也可以用于全基因组甲基化的检测，包括（1）甲基化芯片阵列。芯片阵列上固定有能够识别甲基化与非甲基化CpG的探针，将经过重亚硫酸盐转化后的DNA片段经扩增后与探针结合，从而检测甲基化位点。Illumina公司的HumanMethylation450 BeadChip（HM450）[16，17]以及Infinium MethylationEPIC BeadChip[18]都属于此类。（2）全基因组亚硫酸氢盐测序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）。检测步骤是文库制备及测序。基因组DNA被打断成片段，末端加A修饰后与甲基化连接头（methylated adapters）连接[19]，经片段大小筛选后采用重亚硫酸盐转化，然后PCR扩增并测序。WGBS是目前国际上研究甲基化的项目机构如美国国立卫生研究院（national institute of health，NIH）路线图计划（Roadmap）、由美国人类基因组研究所和欧洲生物信息研究所牵头的ENCODE计划、基因蓝图计划（Blueprint）等采用的标准DNA甲基化检测方法。（3）简化代表性亚硫酸氢盐测序法（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）。RRBS是由Meissner等[20]为降低全基因组DNA甲基化检测的成本在2008年提出，采用Msp1限制性内切酶消化、重亚硫酸盐转化进行文库制备，结合二代测序技术进行检测。

相对而言，重亚硫酸盐转化保留了完整的DNA序列，并且所需的DNA模板量较低，因此成为法医DNA甲基化分析常用的方法，用于甲基化的定性和定量分析。然而该方法对转化条件要求苛刻，会造成DNA的降解。同时，可能存在转化不完全的情况，导致对DNA甲基化比例的过高估计。经转化之后的碱基U在随后的PCR过程中被DNA聚合酶视作T，因此也有可能造成非特异性扩增。

2.2 基于MSRE的技术

MSRE技术是利用限制性内切酶对所识别序列内甲基化位点敏感性的差异来进行甲基化检测[21]。MSRE包括BstUⅠ、HpaⅡ、NotⅠ等，在所识别序列未甲基化时能够对序列进行剪切，甲基化时则不能切割。该方法简单、稳定，但是有两点不足，一是消化不完全对分析结果造成影响，二是在全基因组DNA中酶的识别序列有限，因此对DNA甲基化位点的检测也有限。

2.3 基于MeCP的分析方法

该方法是利用MeCP将酶切或者超声之后的DNA片段进行甲基化富集，随后采用芯片阵列、二代测序等方法进行检测，所采用的结合蛋白包括甲基CpG结合域蛋白（methyl-CpG-binding domain，MBD）[22]和5-mC特异性抗体，后者也称为甲基化DNA免疫共沉淀（methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）法[23]。MeCP技术常用于基因组范围内的甲基化位点扫描，但是对CpG密度以及拷贝数有偏向性，优先富集CpG密度较高的片段[24]。

2.4 利用SMS方法直接检测

SMS技术，也被称为第三代测序（third generation sequencing，TGS）技术，无需PCR扩增的过程，实现了对每一条DNA分子的单独测序[25]。TGS技术主要包括三种：（1）单分子合成测序，包括单分子实时测序（single-molecule real-time sequencing，SMRT）技术[26，27]、荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术[28]；（2）纳米孔测序（nanopore-sequencing）技术，如对穿过纳米孔的碱基电信号差异的检测[29，30]、光信号差异的检测[31]等；（3）利用显微镜对DNA分子直接成像，如透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）技术[32]、扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）技术[33]。其中SMRT以及纳米孔测序技术为DNA甲基化的检测提供了新的可能。

2.4.1 SMRT技术

SMRT技术是由Pacific Biosciences公司所开发，采用零模波导（zero-mode waveguides，ZMW）芯片的合成测序技术。ZMW孔径小于激光波长，因此激光无法直接穿过小孔，而是发生衍射，形成荧光信号检测区，在该区域内锚定有DNA聚合酶。进行测序时，正确配对的碱基进入该区域并滞留数十毫秒，碱基磷酸基团上标记的荧光分子受激光激发发出相应种类的荧光信号，从而获得序列信息。

SMRT所产生的荧光信号的特征不仅仅包括颜色、波长等，还包括荧光信号的持续时间以及两个信号的间隔[27]，后面两者体现的是DNA合成动力学相关的信息。Flusberg等[26]研究表明，DNA甲基化对DNA聚合酶的动力学有影响，甲基化位点5-mC在进行SMRT时产生的荧光信号持续时间比非甲基化位点C要长得多。根据信号持续时间以及间隔时间的差异可以检测不同种类的表观遗传学修饰，包括5-mC、5-hmC以及N6-mA[34]等。与二代测序技术相比，SMRT技术的长读长、不受GC重复的影响等特点使其能够很好地应用于高GC重复区域CpG位点的检测。Suzuki等[35]采用SMRT技术成功对人类高GC重复区域如长散在重复序列（long interspersed nuclear elements，LINE）的甲基化状态进行了检测，并构建新的算法，提高了检测的准确度。

2.4.2 纳米孔测序技术

Oxford Nanopore公司开发的纳米孔单分子测序技术是基于电信号测序的原理，当DNA分子通过结合有核酸外切酶的纳米孔时，通过孔道的碱基被剪切产生一个阻断并形成阻断电流，根据阻断电流的变化检测出相应碱基的种类，最终得到DNA的序列。Laszlo等[36]的研究表明，甲基化的碱基5-mC以及5-hmC与未甲基化的碱基C通过纳米孔通道时所产生的电流均有差异，由此可用于DNA甲基化的检测。

SMS技术为DNA甲基化的检测提供了新的可能。但由于DNA甲基化多态性的特点（同一CpG位点的甲基化状态在不同组织、不同细胞间有可能不同），SMS技术检测DNA甲基化最终的数据呈现形式依然分为低甲基化、中等程度甲基化和高甲基化三种。同时，受限于SMS技术本身的缺点，比如较高的错误率、相对低的通量，SMRT技术会出现插入和缺失错误，纳米孔测序技术不能进行重复测序等，目前尚未能应用于法医学领域。如果克服了准确率以及通量等的局限，相信SMS技术将能很好地应用于DNA甲基化的检测。

3 法医学应用

3.1 年龄推断

随着分子生物学的发展，法医学领域的年龄推断也发展到分子水平。Meissner等[37]总结了四种可以用于年龄推断的机制，包括DNA损伤的累积（主要体现在线粒体DNA片段缺失率）、端粒长度的缩短、天冬氨酸外消旋化以及晚期糖基化终末产物的变化。然而大多数方法对年龄推断的误差都太大。近年，Zubakov等[38]提出了一种基于信号结合T细胞受体删除环（signal joint T-cell receptors excision circles，sjTREC）定量的方法，认为随着年龄的增长sjTREC降低，并且两者具有相关性。Ou等[39]的研究成果与其一致。然而该方法的局限性在于对年龄推断的精度不够，对其他不含有T细胞的组织体液无法使用，同时还受检材来源者免疫状态的影响。

DNA甲基化具有随龄变化的特点，主要成因包括在机体生长过程中随机累积的DNA甲基化变化[40]以及基因组中特定位点因基因表达需要而改变甲基化状态[41]。随着年龄的增长，由于DNA甲基化转移酶DNMT1a酶活性的进行性缺失，总体的DNA甲基化水平呈下降趋势[42]，但在一些特殊位点反而上升，均呈现一定相关性。

很多学者在整体基因组水平对DNA甲基化与年龄的相关性进行了研究。Bocklandt等[43]采用Illumina HumanMethylation27 BeadChip（HM27），检测了来源于34对女性同卵双胞胎检材的88个DNA甲基化位点，最终基于其中三个CpG位点（NPTX2、EDARADD、TOM1L1）的甲基化状态构建一个年龄推断的回归模型，误差为5.2年。Koch等[44]采用同样的方法对来自13种组织细胞类型的检材进行了检测，最终筛选出5个CpG位点构建模型，包括NPTX2、TRIM58、GRIA2、KCNQ1DN以及BIRC4BP，误差为9.3年。Hannum等[45]对71个CpG位点进行检测，能够达到误差3.9年的精度。Freire-Aradas等[46]从已报道的数据中筛选出177个CpG位点，采用EpiTYPER方法对725份欧洲人群样本进行了检测，最终选择出7个与年龄高度相关的位点，并一改以往采用的线性回归方法，采用了多元分位数回归分析，随后在104对同卵双胞胎中进行了验证，可达到误差3.07年的精度。

然而，整体基因组水平的甲基化分析对检材的要求较高，在法医学领域则需寻求一种对检材要求量少、操作简便、精确度相对较高的方法。Weidner等[47]针对3个CpG位点（ITGA2B、ASPA和PDE4C）建立了一个模型，对年龄预测的误差为4.3年。Silva等[48]仅对GRIA2和NPTX2两个位点，采用重亚硫酸盐转化结合焦磷酸测序的技术进行分析，分别构建了两个模型，GRIA2对年龄的预测误差为6.9年，而NPTX2较高，为9.2年。Yi等[49]报道了3个新的甲基化位点并构建了模型，对年龄推断的精度可达4年。

3.2 组织体液来源鉴定

组织体液来源的鉴定有助于刻画犯罪现场、重现犯罪过程，为案件的侦破提供线索与证据。当前常用的来源鉴定方法包括形态学、血清学、mRNA以及DNA甲基化等。形态学方法受检材的限制；血清学方法通过免疫层析检测细胞特异性蛋白对体液来源进行鉴定，存在不稳定性和非特异性；对组织体液来源鉴定研究较多的方法是进行组织特异性mRNA的检测[50，51]，但是该方法也存在一些不足之处，比如在不同体液之间mRNA的表达有较多重叠，在降解或者时间太久的检材中mRNA可能降解等。

追根溯源，组织体液间的差异是来自于基因表达的差异，这种差异与DNA甲基化密切相关[52-54]。全基因组研究发现，在染色体的特定位置上存在tDMR[13]。根据组织细胞类型的不同，tDMR呈现不同的甲基化模式，在某些组织内呈现去甲基化，而在其他组织内则呈现不同程度的甲基化[55，56]。Eckhardt等[57]的研究表明，基因组特定区域甲基化水平在男性和女性之间、不同年龄组之间的差异要远远低于不同组织之间，分别为0.1%、0.275%以及7.1%。因此，稳定性高、特异性较好的DNA甲基化成为一种组织体液来源鉴定的生物标记。

Frumkin等[58]最先把DNA甲基化用于组织体液来源鉴定，其采用MSRE-PCR结合毛细管电泳的方法，成功对血液、唾液、精液、皮肤、尿液以及阴道分泌液等进行了区分。甲基化程度高的位点则产生较强的信号，低甲基化的则信号较低，然而非特异性扩增产物也会对信号产生影响，因此采用位点间信号比值来进行组织类型推断。Lee等[12]则采用重亚硫酸盐转化结合测序的方法对tDMR进行了检测，并筛选出两个精液特异性的tDMR，分别位于DACT1和USP49基因调控区上。在精液中，两个位点去甲基化率均超过90%，而在其他组织（如血液、唾液、阴道分泌液）中则保持着相当高的甲基化率。同时，VASA基因的tDMR也被证明可用于精液的鉴定，因为其只在精液中表达[56]。上述两种方法都只能做到对DNA甲基化的定性，而重亚硫酸盐转化结合焦磷酸测序技术可以达到定量的目的，是一种稳定、常用的方法。Madi等[59]采用重亚硫酸盐转化结合焦磷酸测序技术筛选针对血液、唾液、皮肤以及精液的tDMR位点。由于能够达到定量水平，针对各个特异性位点的分析精确度则更高，比如ZC3H12D基因上5个CpG位点，在血液、唾液及皮肤中显示出82%～100%的甲基化水平，而在精液中的甲基化水平则低于12%。结果显示，ZC3H12D和FGF7能用于精液的鉴定，C20orf117能用于血液的鉴定，BCAS4则可用于唾液的鉴定。Forat等[60]则在基因组水平对组织特异性甲基化位点进行了筛选，采用Illumina公司的HM27 BeadChips和HM450K Beadchips，针对静脉血、月经血、阴道分泌液、唾液和精液的150个候选位点进行了分析，并使用甲基化特异的单核苷酸扩增技术（single nucleotide primer extension，SNuPE）和下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）进行验证，最终筛选出9个特异性位点。Wasserstrom等[61]则将精液特异性的5个DNA甲基化位点加3个质量控制位点制作成了试剂盒，称为Nucleix DSI-Semen试剂盒，对检材检测结果可信度达到0.9999。

DNA甲基化以其稳定性和特异性在组织体液鉴定中受到较多关注，但由于所提供的不是全或无的结果，因此在对混合样本使用时受到限制。很多CpG位点甲基化同时存在于多种组织体液中，同时DNA甲基化受年龄、环境、生活方式的影响也会发生变化，因此在筛选CpG位点的过程中，不仅需要对不同组织进行检测以确定特异性，还需进行大量人群调查以排除个体特异性。疾病如癌症等对DNA甲基化水平的影响也是需要关注的内容之一。

3.3 同卵双胞胎的鉴别

每1000次分娩约有3次是同卵双胞胎[62]，因此在法医学实践中对同卵双胞胎的鉴定并不少见。由于同卵双胞胎的DNA序列完全一致，采用常规的STR检测方法无法对两者进行区分。研究发现，在同卵双胞胎的DNA序列中存在着微小变异以及表观遗传学差异。Weber-Lehmann等[63]采用二代测序方法对一对双胞胎兄弟的精液以及其中一个孩子的血液进行了检测，在父子二人的基因组DNA中发现5个SNP位点，而双胞胎兄弟则不含有该突变。Wang等[64]认为，线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的突变率要高于核基因组DNA，因此检测同卵双胞胎的mtDNA序列有助于对二者进行鉴定，该研究采用二代测序的方法对10对同卵双胞胎的血样进行检测，结果表明该方法可以用于同卵双胞胎的区分。

同卵双胞胎在表观遗传学方面，主要是DNA甲基化的差异[65]。甲基化在某种程度上反映着环境对基因组的影响[66]，包括饮食、生活习惯、生活经历等，因此即使是同卵双胞胎，DNA甲基化也会存在差异性。Boks等[67]采用基因阵列的方法检测了全基因组约1 500个CpG位点，Gervin等[68]采用重亚硫酸盐转化结合焦磷酸测序检测了1760个位点，均证明在同卵双胞胎之间存在DNA甲基化差异。Li等[69]对年龄为17～74岁的13对女性同卵双胞胎和9对男性同卵双胞胎的外周血进行了检测，在3616个CpG位点中筛选出92个具有差异性的位点，能够成功对22对同卵双胞胎进行鉴别。作者还指出由于92个差异性位点是由外周血检测而得出，因此只能用于血液样本的检测。Zhang等[70]采用Illumina公司HM450 Beadchips对10对同卵双胞胎的全基因组DNA甲基化状态进行检测，结果显示，在同卵双胞胎之间有0.087%～1.530%的CpG位点存在差异。同时，由于DNA甲基化具有随龄变化的特性，在法医学检案中，用于同卵双胞胎鉴别的DNA甲基化位点的稳定性就显得十分重要，因此Zhang等[70]还对8个个体（包括一对同卵双胞胎）的血样在时间维度上进行了检测，结果表明在9个月的时间内DNA甲基化没有十分大的变化。此外，Stewart等[71]的研究表明，采用重亚硫酸盐转化结合高分辨率熔解曲线分析对Alu家族的Alu-E2F3以及Alu-SP进行检测也可用于同卵双胞胎的鉴别。

3.4 其他

早在1993年，Natio等[72]就将DNA甲基化用于性别鉴定，检测与X染色体相关的DXZ4基因甲基化状态。Boks等[67]则选择了1 505个常染色体相关的CpG位点，采用Illumina公司GoldenGate阵列对46个男性、46个女性以及92个对照样本进行检测，结果表明DNA甲基化状态在性别之间存在差异。

由于具有亲源特异性，DNA甲基化可用于亲本来源的鉴定。Zhao等[73]采用MSRE-PCR的方法，对印记基因座rs220028进行了研究，证明子代甲基化的等位基因来自于母亲。Nakayashiki等[74，75]采用重亚硫酸盐转化结合测序的方法对5个印迹基因的DNA甲基化进行了检测，确定了H19为母系来源表达基因，而HYMA1、SNRPN以及PEG3则为父系来源表达基因。采用DNA甲基化对印记基因座亲本来源进行鉴定是对传统STR分型的有效补充。

此外，DNA甲基化还可用于DNA样本的确证。Frumkin等[76]的研究表明，采用适当的方法，DNA样本可以在体外人工合成，如果放置于犯罪现场将误导侦查。该研究同时指出，人工合成的DNA均无甲基化，因此可以应用甲基化检测以鉴别是否人工合成。

4 小结

DNA甲基化含有丰富的信息量，可以作为STR、SNP等经典遗传标记的有效补充，提供检材性别、体液来源、年龄、同卵双胞胎甄别等信息，在法医学领域显示出一定的应用价值。但DNA甲基化较为复杂，在应用过程中需注意位点的筛选、检材的选择以及检测方法的选择。选择已知的位点或者通过全基因组检测筛选新的合适的位点，是DNA甲基化应用的前提。由于甲基化在不同组织中可能存在不同的状态，因此在构建应用位点体系时，尤其是在体液来源鉴定时，对检材组织类型的筛选十分重要。检测方法需要灵敏度高、特异性好，以适应微量或降解检材的需求。TGS技术为DNA甲基化的检测提供了新的途径。相信随着研究的深入和技术的发展，DNA甲基化在法医学领域将会有很好的应用前景。

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Research Progress on the Detection Method of DNA Methylation and Its Application in Forensic Science

NIE Yan-chai,YU Li-juan,GUAN Hua,ZHAO Ying,RONG Hai-bo,JIANG Bo-wei,ZHANG Tao
（First Research Institute of the Ministry of Public Security of PRC,Beijing 100022,China）

As an important part of epigenetic marker,DNA methylation involves in the gene regulation and attracts a wide spread attention in biological auxology,geratology and oncology fields.In forensic science,because of the relative stable,heritable,abundant,and age-related characteristics,DNA methylation is considered to be a useful complement to the classic genetic markers for age-prediction,tissueidentification,and monozygotic twins’discrimination.Various methods for DNA methylation detection have been validated based on methylation sensitive restriction endonuclease,bisulfite modification and methylation-CpG binding protein.In recent years,it is reported that the third generation sequencing method can be used to detect DNA methylation.This paper aims to make a review on the detection method of DNA methylation and its applications in forensic science.

forensic genetics;DNA methylation;review;twins,monozygotic;third generation sequencing

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.017

1004-5619（2017）03-0293-08

2016-11-21）

（本文编辑：张素华）

聂燕钗（1988—），女，硕士，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：nieyanchai＠163.com