miRNA-29b在颅内动脉瘤组织中的表达变化及意义

彭浩，赵建农，陈健龙，王鹏程，张茂

(海南省人民医院，海口570311)

miRNA-29b在颅内动脉瘤组织中的表达变化及意义

彭浩，赵建农，陈健龙，王鹏程，张茂

(海南省人民医院，海口570311)

目的 观察微小RNA-29b(miRNA-29b)在颅内动脉瘤组织中的表达变化，并探讨其意义。方法 取20例颅内动脉瘤患者颅内动脉瘤组织、脑肿瘤患者正常脑动脉作为标本；制备大鼠颅内动脉瘤模型，取其颅内动脉瘤组织及正常脑动脉作为标本。用qRT-PCR技术检测以上标本中miRNA-29b表达。将培养好的人主动脉平滑肌细胞随机分为实验组和对照组，按照Lipofectamine 2000将miRNA-29b mimics、miRNA mimics NC分别转染入实验组、对照组，转染24 h取实验组部分细胞经20 mg/L ox-LDL干预24 h。用qRT-PCR技术检测细胞内miRNA-29b、自噬基因(Beclin1) mRNA表达；用Western blotting法检测细胞内Beclin1、微管相关蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ)蛋白表达；用双荧光素酶实验检验Beclin1是否为miRNA-29b的靶基因;用MTT法检测细胞增殖率。结果 人与大鼠颅内动脉瘤组织中miRNA-29b相对表达量均低于正常脑动脉组织(P均<0.05)。经ox-LDL刺激的人平滑肌细胞内miRNA-29b相对表达量低于未经ox-LDL刺激的细胞(P<0.05)。转染48 h，实验组Beclin1 mRNA及蛋白相对表量低于对照组，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量高于对照组(P均<0.05)。荧光素酶实验证实miRNA-29b可与Beclin1 mRNA 的3′-UTR结合，Beclin1是miRNA-29b的靶基因。转染48 h，实验组细胞增殖率低于对照组(P<0.05)。结论 miRNA-29b在颅内动脉瘤组织中表达下调，其可能通过介导靶基因Beclin1调控平滑肌细胞的自噬，从而参与颅内动脉瘤的发生。

颅内动脉瘤；微小RNA-29b；平滑肌细胞；自噬基因；细胞自噬

颅内动脉瘤是指脑动脉内腔异常扩大，甚至出现动脉壁异常膨出的现象。颅内动脉瘤破裂可引起颅内大量出血及蛛网膜下腔出血[1]。颅内动脉瘤起病隐匿，在其破裂发病前较难发现；动脉瘤破裂后，患者预后极差，多数死亡[2]。因此，研究颅内动脉瘤的发病机制极其重要。有研究表明，其发病机制包括细胞外基质结构改变、补体激活的炎症浸润等[3]。近来有多项关于微小RNA(miRNA)的研究，miRNA能够在转录后水平调控其靶基因[4]，在多种心血管疾病发病中发挥重要作用。研究证实，腹主动脉瘤患者存在miRNA表达谱异常[5～9]。miRNA-29参与调节胶原蛋白、弹力蛋白及纤维蛋白的表达，保护主动脉血管壁结构的完整性，在心肌纤维化过程中也发挥重要作用[10～12]，但miRNA-29b是否参与颅内动脉瘤发生发展过程尚未见相关报道。2014年9月～2015年8月，本研究对以上观点进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.1.1 人动脉瘤组织标本及正常动脉标本 收集本院同期收治行开颅夹闭术的颅内动脉瘤患者20例，经影像学检查确诊；男13例、女7例，年龄(42.27±5.21)岁；取其颅内动脉瘤组织做标本。同期选择接受开颅手术治疗的脑肿瘤患者20例，男15例、女5例，年龄(43.56±3.87)岁；取其正常颞浅动脉(STA)和(或)脑膜中动脉(MMA)做标本。患者入选标准：颅内恶性肿瘤为原发病灶，未累及STA和(或)MMA；排除严重肝肾功能损害、心血管疾病、血液病、颅外恶性肿瘤等。颅内动脉瘤患者、脑肿瘤患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

1.1.2 大鼠动脉瘤组织标本及正常脑动脉标本 SPF级SD雄性大鼠40只，体质量200～250 g，购自广东医科大学动物实验中心。随机选取20只大鼠用猪胰弹性蛋白酶滴加到颈外动脉及分叉处动脉壁周围，在颈外动脉距分叉处约1.5 mm，用两根手术线结扎颈外动脉，于两根线之间剪断颈外动脉，使颈外动脉的盲段形成1个颈内动脉瘤。术后1周给予1%盐水饲养。1个月后行脑血管造影，观察动脉瘤形成情况。另外20只大鼠常规饲养未做处理。术后2个月，股静脉放血处死大鼠，分别从大鼠颈总动脉分叉部取颅内动脉瘤组织标本及正常动脉标本。

1.2 主要试剂与仪器 人主动脉平滑肌细胞株(美国ATCC公司)；RNA提取试剂(北京博奥森生物技术有限公司)，miRNA Reverse Transcription 试剂盒、SYBR Green mix kit(德国凯杰Qiagen公司)，PCR扩增引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，miRNA-29b(广州市锐博生物科技有限公司)，微管相关蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ)多克隆抗体(CST)，自噬基因(Beclin1)抗体(Abcam艾美捷科技有限公司)；DMEM培养基、胎牛血清(GE Healthcare Life Sciences)；蛋白提取试剂盒、BCA定量试剂盒、AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；NanoDrop-2000c紫外分光光度计(Thermo Scientific，美国)，扩增PCR仪、荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)等。

1.3 人主动脉平滑肌细胞培养及转染 在超净台中将液氮保存的人主动脉平滑肌细胞悬液吹打混匀后在室温离心机中800 r/min离心5 min，弃上清液，往下层细胞沉淀中加入含10% FBS DMEM高糖培养基5 mL轻轻吹打混匀，转入25 cm2细胞培养瓶中，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。当细胞生长融合程度为30%时，进行转染。将细胞随机分为两组，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书将miRNA-29b mimics(模拟内源miRNA-29b)、miRNA mimics NC(阴性对照)分别转染入实验组、对照组。转染后于含10% FBS DMEM高糖培养基中继续培养。

1.4 颅内动脉瘤组织、正常脑动脉与人主动脉平滑肌细胞中miRNA-29b表达检测 采用qRT-PCR技术。取人与大鼠的颅内动脉瘤组织与正常脑动脉组织标本，每100 mg组织加入1 mL TRIzol试剂，加入氯仿0. 2 mL，剧烈振荡15 s，冰上静置3～5 min。4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。吸取上层透明液体放入新的Eppendorf管，加入与上层透明液体等体积的异丙醇，上下颠倒2 min混匀后放置于冰上10 min。再次于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。弃上清液保留沉淀，加入4 ℃预冷的75%乙醇1 mL，12 000 r/min离心5 min。吸弃上清液后室温干燥3 min。加入4 ℃ DEPC水充分混合溶解。取实验组部分细胞经20 mg/L ox-LDL干预24 h，用胰酶消化后离心加入TRIzol试剂，其后步骤与组织样本RNA提取相同。按照SYBR Green PCR试剂盒说明书，以逆转录合成的cDNA作为模版在qRT-PCR仪上进行反应。PCR反应体系：模版cDNA 0.2 μL，miRNA-29b特异性引物0.6 μL，2× QuantiTect SYBR Green PCR Mix 5 μL，miRNA-29b上游引物为5′-CTGACGGAGTTCCTCCAGTTC-3′，下游引物为5′-GAGGTTCCCCGAGAAGACGAT-3′；U6作为内参，其上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，加DEPC水至反应总体积为10 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，随后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。经qRT-PCR扩增得到各目的基因循环阈值(Ct)，以2-ΔΔCT法计算miRNA-29b的相对表达量。

1.5 人主动脉平滑肌细胞中Beclin1相对表达量检测 用qRT-PCR技术。转染24 h，收集实验组、对照组细胞，检测步骤同1.4。Beclin1上游引物为5′-AGGAGCAGTGGACAAAGG-3′，下游引物为5′-AGGGAAGAGGGAAAGGAC-3′；β-actin为内参，上游引物为5′-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3′，下游引物为5′-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3′。

1.6 人主动脉平滑肌细胞Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取转染48 h实验组、对照组总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒定量，根据蛋白浓度按比例加入5×SDS上样缓冲液，在加热器中于100 ℃加热10 min使蛋白变性。制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔蛋白上样量为30 μg，常规电泳、转膜、封闭，加入Beclin1抗体(1∶1 000稀释)、LC3Ⅱ/Ⅰ抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。取出条带TBST洗涤3次，每次10 min，孵育兔二抗(1∶5 000稀释)，室温孵育2 h后使用TBST洗涤3次，ECL发光液浸泡条带后使用BIO-RAD显影仪显影。使用ImageJ测定各蛋白灰度值，计算目的条带与内参条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。

1.7 miRNA-29b的靶基因检测 采用双荧光素酶实验。培养人平滑肌细胞，按合适的细胞数铺6孔板，当细胞长至30%～50%时，将miRNA-29b mimics与Beclin1基因重组质粒转染细胞。转染6 h将转染时所用不含血清的培养基更换为完全培养基，48 h后使用胰酶消化法收集细胞，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega) 试剂盒说明书分别检测萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶，验证靶基因是否正确。Beclin1 3′-UTR(WT)荧光素酶相对活性降低而Beclin1 3′-UTR(MUT)荧光素酶相对活性正常时，表明Beclin1是miRNA-29b的靶基因。

1.8 人动脉平滑肌细胞增殖率检测 采用MTT法。转染48 h收集实验组、对照组细胞，置于96孔板内(7 000/孔)。用MTT细胞活性检测试剂盒进行检测，用酶标仪测490 nm波长处吸光度值。细胞增殖率=实验组吸光度值/阴性对照组吸光度值×100%，以上实验重复3次。

2 结果

2.1 人与大鼠颅内动脉瘤组织、人平滑肌细胞内miRNA-29b的表达 人颅内动脉瘤组织、人正常脑动脉组织内miRNA-29b相对表达量分别为0.47±0.09、1.22±0.46，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠颅内动脉瘤组织、大鼠正常脑动脉组织内miRNA-29b相对表达量分别为0.27±0.04、0.95±0.12，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。转染24 h，未经ox-LDL刺激与经ox-LDL刺激的人平滑肌细胞内miRNA-29b相对表达量分别为0.93±0.13、0.47±0.08，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miRNA-29b对人平滑肌细胞内Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响 转染48 h，实验组与对照组Beclin1 mRNA相对表达量分别为0.56±0.05、0.92±0.07，Beclin1蛋白相对表达量分别为0.45±0.11、0.17±0.15，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量分别为0.92±0.22、0.30±0.23；两组Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 荧光素酶实验结果 靶基因Beclin1荧光素酶实验证实miRNA-29b可与Beclin1 mRNA 的3′-UTR结合，当该结合部位发生突变后，结合能力消失。

2.4 miRNA-29b对人平滑肌细胞增殖率的影响 转染48 h，实验组与对照组细胞增殖率分别为0.36%±0.11%、0.69%±0.13%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

颅内动脉瘤是脑血管疾病三大病因之一，可引起自发性蛛网膜下腔出血，其病死率和致残率较高。近年来随着影像技术发展及手术水平的提高，颅内动脉瘤破裂导致的自发性蛛网膜下腔出血能得到及时诊治，但病死率仍无明显改观[13]。因此对其发生发展及破裂的预防成为目前研究热点。颅内动脉瘤的发生是多种因素共同作用的结果，动脉粥样硬化在其中起重要促进作用[14]。ox-LDL的异常增加，对血管内皮细胞、平滑肌细胞等产生持续刺激，是动脉粥样硬化发生发展的主要危险因素。越来越多的证据表明，血管壁中的内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等持续培养于高浓度ox-LDL的环境下，会出现细胞自噬、凋亡增加、增殖减少，但其具体机制尚未完全阐明。自噬是继细胞坏死、凋亡之后新发现的一种程序性细胞死亡，是细胞器和大分子蛋白降解的主要途径，进而维持细胞内环境稳态。近年来研究发现，自噬调控失调与多种疾病的发生发展有关，如自身免疫病、肿瘤、衰老、心脑血管等慢性疾病及神经系统相关疾病[15]。研究提示，颅脑动脉瘤的发生发展与血管平滑肌细胞的自噬密切相关[16]。

miRNA是一类小分子非编码调节性RNA，含有22～25个核苷酸，这类RNA分子可与靶向基因的3′-UTR端特异性结合，并通过完全配对导致mRNA的降解或通过不完全配对抑制翻译，从而参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，影响疾病的发生发展[4]。近年来，越来越多的证据表明，miRNA通过调控血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管细胞外基质等的功能，从而参与动脉粥样硬化和血管重构，在动脉瘤的发生发展中也起重要的作用。miRNA-29家族包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c三个成员。既往研究发现，在胸主动脉瘤中，仅miRNA-29b的表达较正常人升高，而miRNA-29a和miRNA-29c无明显改变；但另外一项队列研究发现，腹主动脉瘤患者的miRNA-29b表达下调[17～19]。上述结果提示miRNA-29b可能在不同动脉瘤类型中表达水平不同，进而发挥不同的作用。此外，多项研究证实，miRNA-29b在细胞外基质的降解中发挥重要作用，并在年龄相关的动脉瘤形成中发挥一定促进作用。在小鼠体内，抑制miRNA-29b可以减缓腹主动脉瘤的进展[20]。但是其在动脉粥样硬化相关的颅脑动脉瘤中表达如何及是否发挥作用尚未见报道。本研究通过对比颅脑动脉瘤及正常人动脉组织中miRNA-29b表达，发现其在动脉瘤患者动脉组织中表达显著下调，在apoe-/-动脉粥样硬化模型小鼠动脉组织中也得到相同的结论，提示miRNA-29b可能参与颅脑动脉瘤的发生发展。但其在颅脑动脉瘤发生发展中如何发挥调控作用，目前尚不清楚。本研究通过对比ox-LDL处理及未处理的平滑肌细胞中miRNA-29b的表达发现，ox-LDL刺激细胞后，miRNA-29b表达降低，提示miRNA-29b可能通过影响平滑肌细胞的功能从而参与颅脑动脉瘤的发生发展。

在颅脑动脉瘤发生发展中，平滑肌细胞的自噬可影响动脉瘤的进展[16]。本研究发现，miRNA-29b在ox-LDL干预的平滑肌细胞中表达降低，增加miRNA-29b表达可抑制平滑肌细胞增殖，并伴随细胞自噬标志性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达降低，提示miRNA-29b可能通过影响平滑肌细胞自噬从而参与颅脑动脉瘤的进程。为进一步观察miRNA-29b的表达导致平滑肌细胞自噬的靶基因，我们通过预测软件及数据库搜索等进行了miRNA-29b靶基因的预测，发现Beclin1可能是其靶基因之一。体外实验也证实，过表达miRNA-29b后，可显著下调Beclin1的mRNA及蛋白水平。上述结果提示，miRNA-29b可能通过介导Beclin1的表达从而调控平滑肌细胞的自噬进而参与颅脑动脉瘤的发生发展过程。

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海南省自然科学基金资助项目(20158354)。

赵建农(E-mail: zjn@vip.163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.009

R732.21

A

1002-266X(2017)05-0029-03

2016-11-04)