远华蟾毒精对小鼠乳腺癌细胞侵袭的抑制作用及机制

曹珍，高玉雪，徐金媛，王茹燕，李峰，朱学涛，史立宏，吕世军

(潍坊医学院，山东潍坊261000)

远华蟾毒精对小鼠乳腺癌细胞侵袭的抑制作用及机制

曹珍，高玉雪，徐金媛，王茹燕，李峰，朱学涛，史立宏，吕世军

(潍坊医学院，山东潍坊261000)

目的探讨远华蟾毒精对小鼠乳腺癌细胞侵袭的抑制作用及其机制。方法将培养好的小鼠乳腺癌细胞4T1随机分为A、B、C、D组。A组常规培养；B、C、D组于缺氧条件下(37 ℃、5% CO、95% N2)进行培养，同时C、D组分别加入0.1、0.5 μmol/L远华蟾毒精进行培养。培养0、6、12、24 h采用划痕实验检测细胞迁移能力(迁移距离)，用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力(穿膜细胞数)，用Western blotting法检测细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)及磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白表达。结果不同时点细胞迁移距离D组

乳腺癌；远华蟾毒精；细胞侵袭；4T1细胞；中药

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。细胞外基质的降解是肿瘤发生侵袭和转移的关键因素。基质金属蛋白酶(MMP)是与肿瘤侵袭和转移关系最密切的一类蛋白水解酶[1，2]。在肿瘤微环境中，缺氧是促进肿瘤增殖侵袭的主要因素。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)可介导肿瘤细胞对缺氧条件的反应，其在缺氧条件下才可以稳定表达[3，4]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路是细胞内重要的信号通路之一，参与多种重要生物学过程的调控。其通过影响下游多种效应分子的活化状态，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，与乳腺癌的发生、发展密切相关[5]。有研究表明，蟾酥可抑制肺癌细胞生长和侵袭，但未证明是其中哪种单体化合物具有该作用[6]。本课题组发现，蟾酥中提取的单体化合物远华蟾毒精可明显抑制小鼠乳腺癌细胞的非定向迁移、定向趋化运动和对细胞外基质的侵袭，而其分子作用机制尚不清楚。2015年9月～2016年12月，本研究对此进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂来源 小鼠乳腺癌细胞系4T1由潍坊医学院医学研究实验中心提供。远华蟾毒精购自上海晶都生物技术有限公司、兔抗MMP-2单抗、兔抗MMP-9单抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗HIF-1α单抗、兔抗磷酸化的PI3K及磷酸化的AKT单抗购自美国Santa Cruz公司；RPMI1640培养基和类胎牛血清购自美国Hyclone公司；Transwell小室、细胞培养板购自Sigma公司；Matrigel购自BD公司。

1.2 实验药物浓度确定及细胞分组 将4T1细胞于37 ℃、5% CO2条件下常规培养。细胞接种于96孔板常规培养24 h，分别加入浓度0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5 μmol/L远华蟾毒精再孵育24 h，每孔加入MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，终止培养，用酶联免疫检测仪检测各孔波长490 nm处的吸光度值。以药物浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。通过细胞生长曲线可见0.5 μmol/L浓度内的远华蟾毒精对细胞增殖影响较小，大于该浓度时明显抑制细胞增殖。确定远华蟾毒精实验浓度为0.1、0.5 μmol/L。将培养好的细胞随机分为A、B、C、D组。A组常规培养；B、C、D组于缺氧条件下(37 ℃、5% CO、95% N2)进行培养，同时C、D组分别加入0.1、0.5 μmol/L远华蟾毒精进行培养。

1.3 4T1细胞迁移能力检测 采用划痕实验。各组细胞在6孔板中培养，每个孔平行划三道痕。分别于培养0、6、12、24 h在低倍镜(×100)下拍照，统计每孔不同时间点划痕距离。实验重复3次，取平均值。

1.4 4T1细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭实验。取各组细胞，按照文献[7]进行操作，24 h后将小室置于高倍镜下观察拍照，随机计数5个高倍镜视野下穿过人工基膜的细胞数。实验重复3次，取平均值。

1.5 4T1细胞HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组细胞培养24 h，裂解，提取细胞总蛋白，制备凝胶，各组加入等量蛋白后电泳、转膜、封闭、滴加一抗MMP-2、MMP-9、HIF-1α、p-PI3K、p-Akt孵育过夜，二抗孵育后化学发光剂显影，曝光。目标蛋白相对表达量=(目标蛋白条带灰度值-内参蛋白条带灰度值)/内参蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 远华蟾毒精对4T1细胞迁移能力的影响 药物干预0、6、12、24 h，A组迁移距离分别为(2.6±0.56)、(2.8±0.42)、(3.0±0.37)、(3.3±0.51)μm；B组分别为(3.0±0.43)、(3.4±0.55)、(3.7±0.39)、(3.9±0.48)μm；C组分别为(2.4±0.36)、(2.6±0.33)、(3.0±0.52)、(3.2±0.47)μm；D组分别为(1.5±0.57)、(1.7±0.53)、(1.6±0.49)、(1.8±0.46)μm。不同时点细胞迁移距离D组

2.2 远华蟾毒精对4T1细胞侵袭能力的影响 药物干预24 h，A组穿膜细胞数为65个/5个视野，B组为70个/5个视野，C组为50个/5个视野，D组为30个/5个视野。穿膜细胞数D组

2.3 远华蟾毒精对4T1细胞HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白表达的影响 药物干预24 h，A组HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量分别为1.0±0.12、1.0±0.09、0.8±0.06、0.7±0.06；B组分别为1.0±0.13、1.8±0.15、4.0±0.22、2.6±0.18；C组分别为0.6±0.05、0.6±0.04、0.5±0.07、0.4±0.09；D组分别为0.2±0.04、0.1±0.03、0.1±0.02、0.2±0.03。HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量D组

3 讨论

研究表明，蟾酥具有确切的抗肿瘤活性，能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞分化，还有逆转耐药性、抑制肿瘤血管形成及增强免疫等作用[8，9]。远华蟾毒精是蟾酥提取物，可抑制癌细胞的生长，使荷瘤小鼠存活时间延长。本品可抑制肿瘤细胞恶液质的产生，亦可抑制恶液质素对正常细胞的影响，从而预防肿瘤患者恶液质。远华蟾蜍精中的途氧化苦参碱有抗乙型肝炎病毒的作用，可降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内HBsAg和HBcAg的含量，且对两者作用一致，无选择性。氧化苦参碱是一种较强的免疫抑制剂，可以抑制多种炎性因子的释放，有明确的抗炎作用。本研究发现，远华蟾毒精可抑制乳腺癌细胞的增殖与侵袭。

研究表明，在人类很多常见的恶性肿瘤和癌前病变组织中均有不同程度的HIF-1表达，而在其相应的正常组织中表达变化并不明显。HIF-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内，常氧下也有表达，但合成的HIF-1蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，只有在缺氧条件下HIF-1才可稳定表达[10]。HIF-1β亚基在细胞质中稳定表达，而HIF-1α亚基在翻译后即被泛素蛋白酶水解复合体降解。因此，在正常氧饱和度下的细胞中基本检测不到亚基的表达；而在缺氧状态下，仅亚基的降解被抑制，1α和β亚基形成有活性的HIF-1α，转移到细胞核内，调节多种基因的转录。因此本研究设计在缺氧环境下培养细胞有利于HIF-1α的稳定表达，经检测其在缺氧环境下高表达，经远华蟾毒精干预后HIF-1α表达降低，验证了远华蟾毒精对HIF-1α的抑制作用。

MMP是一个大家族，因其需要Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。MMP几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分(明胶、纤维蛋白及基底膜Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原)，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，导致肿瘤细胞浸润结缔组织基质，侵入小血管和淋巴管，可见其在肿瘤侵袭转移中起关键作用，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶[11，12]。MMP家族已分离鉴别出26个成员，根据作用底物以及片断同源性，将MMP分为6类，明胶酶为其中重要的一类。明胶酶主要分为两个亚型，一种被糖化，为MMP-9；另一种非糖化，为MMP-2。MMP-9与MMP-2在细胞外基质降解中起关键作用，因而与乳腺肿瘤侵袭转移的关系密切[13]。本研究也验证了MMP-9作为HIF-1α的下游因子在乳腺癌细胞中异常表达，远华蟾毒精对MMP-9表达有抑制作用。

PI3K/Akt信号传导通路与乳腺癌发生发展密切相关，且只有在磷酸化时才发挥作用。PI3K磷脂酰基醇是真核生物细胞膜的组成部分，PI3K激活可以调节肿瘤细胞生长、抗凋亡。Akt是一种苏氨酸/丝氨酸激酶，是PI3K下游的主要效应分子之一，PI3K/Akt信号通路在人类很多恶性肿瘤(乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胰腺癌等)中都可以被激活，且乳腺癌中这条信号通路的活化高达70%[14]。本研究检测乳腺癌细胞中p-PI3K、p-Akt在缺氧环境下表达增加，经远华蟾毒精干预后表达降低，说明远华蟾毒精可能通过PI3K/Akt通路发挥作用。

综上所述，本实验证实远华蟾毒精通过PI3K/Akt信号传导通路抑制HIF-1α 、MMP-9蛋白的表达，从而抑制乳腺癌细胞侵袭转移。

[1] Burney IA, Furrukh M, Almoundhri MS. What are our options in the fight against breast cancer[J]. Sultan Qaboos Univ Med J, 2014,14(2):149-151.

[2] Stankovic S, Konjevic G, Gopcevic K, et al. Activity of MMP-2 and MMP-9 in sera of breast cancer patients[J]. Pathol Res Pract, 2010,206(4):241-247.

[3] Marx J. How cells endure low oxygen[J]. Science, 2004,303(5663):1454-1456.

[4] Semenza GL. Defining the role of hypoxia-inducible factor 1 in cancer biology and therapeutics[J]. Oncogene, 2010,29(5):625.

[5] Zhang G, Zhong LI, Lin XM. Expression of PI3K/AKT signal pathway in breast cancer and the clinical significance[J]. MCHCC, 2015,30(20):3475-3478．

[6] Yin PH, Liu X, Qiu YY, et al. Anti-tumor activity and apoptosis-regulation mechanisms of bufalin in various cancers: new hope for cancer patients[J]. APJCP, 2012,13(11):5339-5343.

[7] Marshall J.Transwell invasion assays[J]. Methods Mol Biol, 2011,769(2):97.

[8] Liang ST, Li Y, Li XW, et al. Mechanism of colon cancer cell apoptosis induced by telocinobufagin: role of oxidative stress and apoptosis pathway[J]. J South Med Univ, 2016,36(7):921.

[9] Wu SC, Fu BD , Shen HQ, et al. Telocinobufagin enhances the Th1 immune response and protects against Salmonella typhimurium infection[J]. Int Immunopharmacol, 2015,25(2):353-362.

[10] Wang D, Zhu B, Wu S, et al. HIF-1α and MMP-9 promote angiogenesis in infiltrating breast carcinoma[J]. JHC, 2015,24(5)：1004-1850．

[11] Malemud CJ. Matrix metalloproteinases (MMPs) in health and disease: an overview[J]. Front Biosci, 2006,11(2):1696.

[12] Gonzalez-Perez RR, Xu Y, Guo S, et al. Leptin upregulates VEGF in breast cancer via canonic and non-canonical signalling pathways and NFkB/HIF-1α activation[J]. Cell Signal, 2010,22(9):1350.

[13] Boushell LW. MMPs.[J]. J Esthet Restor Dent, 2013,25(4):217-218.

[14] López-Knowles E, O′Toole SA, Mcneil CM, et al. PI3K pathway activation in breast cancer is associated with the basal-like phenotype and cancer-specific mortality[J]. Int J Cancer, 2010,126(5):1121-1131.

InhibitoryeffectofYuanhuatoadpoisonfineoninvasionofmousebreastcancercells

CAOZhen,GAOYuxue,XUJinyuan,WANGRuyan,LIFeng,ZHUXuetao,SHILihong,LYUShijun

(WeifangMedicalUniversity,Weifang261000,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect and mechanism of Yuanhua toad poison fine on the invasion of mouse breast cancer cells.MethodsThe cultured mouse breast cancer cells 4T1 were randomly divided into groups A, B, C, and D. Cell in the group A

the conventional culture; cells in the groups B, C, and D were cultured under the hypoxic conditions (at 37 ℃, 5% CO and 95% N2); while cells in the groups C and D were added with 0.1 and 0.5 mol/L Yuanhua toad poison fine culture. At 0, 6, 12, and 24 h, the cell migration ability was examined by Scratch test (migration distance); the invasive ability was detected by Transwell invasion test (Number of cells through die); the relative expression levels of HIF-1α, matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), and p-Akt protein were detected by Western blotting.ResultsThe migration distance of each group at different time points was in the following order: group D< group C< group B< group A, the number of transmembrane cells: group D< group C< group B< group A, the expression of HIF-1α, MMP-9, p-PI3K, and p-Akt protein: group D< group C< group B< group A, and the differences in the above indexes were statistically significant between these two groups (allP<0.05).ConclusionYuanhua toad poison fine can decrease the expression of HIF-1α and MMP-9 through the PI3K/AKT pathway, thereby inhibiting the invasion of breast cancer cells.

breast carcinoma; Yuanhua toad poison fine; cell invasion; 4T1 cells; traditional Chinese medicine

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.006

R737.9

A

1002-266X(2017)37-0018-03

山东省自然科学基金资助项目(H1622)。

曹珍(1991-)，女，在读硕士，主要研究方向为乳腺癌的侵袭与转移。E-mail:2425278948@qq.com

吕世军(1961-)，男，博士，教授，主要研究方向为乳腺癌的侵袭与转移。E-mail:sjlu@wfmc.edu.cn

2017-06-10)