选择性剪接与无义介导的mRNA降解机制研究进展＊

陈 彬，孙 珏，谢曼丽，赵爱光，陈伟霞

人类基因数目远少于蛋白质种类，mRNA的选择性剪接（alternative splicing，AS）是增加蛋白质种类和数量，使有限基因表达出更多蛋白质的主要机制［1－3］。AS 还与无义介导的 mRNA 降解（nonsense mediated mRNA decay，NMD）机制相偶联，当某种基因表达异常升高时，通过AS产生能被NMD降解的mRNA剪接异构体而下调该基因表达，使其维持在正常范围。已知AS和NMD与人类多种遗传病和癌症发生密切相关［4，5］。 现就 AS和 NMD 作用机制做一简要综述。

1 选择性剪接（AS）

人类基因由编码蛋白质的外显子（exon）和不编码的内含子（intron）共同构成。基因初始转录产物称为前体 mRNA（pre－mRNA），同样由外显子和内含子共同构成，需要通过AS进而形成成熟的mRNA。在AS中前体mRNA通过不同剪接方式产生具有不同外显子含量的mRNA剪接异构体。通过AS形成不同的成熟mRNA剪接异构体，进而翻译成结构和功能相似或相反的蛋白质。人类基因约92%～94%［6］存在选择性剪接现象。

1.1 前体mRNA选择性剪接的基本机制 AS的过程包括两个步骤：（1）内含子套索的形成，即内含子5'端与该内含子3'端上游分支位点一个 “A”碱基结合；（2）内含子套索前面一个外显子3'端连接到后一个外显子5'端，从而完成内含子的剪切和外显子的拼接。 剪接体（spliceosome）包括 U1、U2、U4、U5和U6五种小核糖核蛋白复合体 （small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNPs），以及以 SR 蛋白和 hnRNP 蛋白为主的多种非 snRNP 相关蛋白［7－9］。

剪接体形成开始于UlsnRNP结合至5'剪接位点和 SF1（splicing factor 1）、U2snRNP 结合至 3'剪接位点处的分支点 （branch point sequence，BPS），其中U2snRNP的结合需辅助因子U2AF（U2snRNP auxiliary factor），U2AF 由 65kDa和 35kDa两个亚基组成，U2AF65结合到多聚嘧啶区（polypyrimidine tract，PPT），U2AF35 识别 3'剪接位点的 AG，然后U2snRNP结合到分支点上，从而形成剪接前体。进一步在ATP作用下U4/U6、U5snRNPs及一系列的非snRNP剪接因子增加到剪接体中，从而完成剪接体组装过程。经过两个连续转酯反应完成内含子的剪切和外显子的拼接［10］。

1.2 选择性剪接主要方式 AS主要有5种方式：（1）外显子跳读，即剪接掉一个或多个外显子；（2）5'和3'剪切位点的选择，即通过对5'剪切供点或3'剪切受点的选择，而保留或剪切掉某一外显子的全部或部分序列；（3）互斥外显子，即经过剪接后，两个外显子不能同时出现在同一个转录本中；（4）对5'和3'末端进行的选择性剪接，该区域的变化会对mRNA稳定性及蛋白表达有影响；（5）内含子保留，即保留或剪切掉一段内含子序列。

1.3 选择性剪接的调控机制 AS受多种顺式作用元件和反式作用因子相互作用调控［11］。

1.3.1 顺式作用元件 顺式作用元件主要有外显子剪接增强子 （exon splicing enhancers，ESEs）、内含子剪接增强子 （intronic splicing enhancers，ISEs）、外显子剪接沉默子（exon splicing silencers，ESSs）和内含子剪接沉默子 （intronic splicing silencers，ISSs），分别促进或抑制对特定剪接的选择。

1.3.2 反式作用因子 调控AS的反式作用因子主要有SR（serine－arginine rich）蛋白家族和核不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）家族。 SR 蛋白通常作为激活蛋白［12］，而hnRNP蛋白则作为抑制蛋白。（1）SR蛋白家族。SR蛋白家族包括SR蛋白和SR相关蛋白。SR蛋白家族含有1个或2个RNA识别基序（RRM），并在C端有富含丝氨酸/精氨酸的RS区域。SR蛋白与RNA的结合活性由RRM决定，RS区域则决定了蛋白质间的相互作用。（2）hnPNP蛋白家族。在AS的负调控中，hnRNP能与抑制元件相互作用，通过与新生mRNA结合而发挥抑制AS的作用。现研究最清楚的hnPNP蛋白为多聚嘧啶区域结合蛋白1（polypyrimidine tract binding protein1，PTBP1）。PTBP1通过与U2AF竞争结合多聚嘧啶区域，对3'剪接位点起负调控作用；还能抑制5'剪接位点，并包裹外显子使其不与剪接体结合而产生外显子跳读［13－15］。

很多基因的 AS 都受到 PTBP1 的调节［16，17］。PTBP1有两种旁系同源蛋白—PTBP2和PTBP3，同样对AS起负调控作用。PTBP1能通过AS和NMD机制来调节PTBP2和PTBP3基因的表达水平，沉默PTBP1基因后能上调PTBP2和PTBP3表达［17］，表明hnPNP蛋白之间可通过AS和NMD途径相互调节。

2 无义介导的mRNA降解（NMD）

NMD 最早由 Losson 等［18］发现，1999 年 Hentze等［19］在Cell杂志报道后，从此使NMD得到了重视。NMD是一种细胞内mRNA监控机制，能检测并快速降解含有无义密码子 （premature termination codons，PTC）突变的 mRNA［20］。 被 NMD 机制降解的mRNA 均存在PTC，故PTC是mRNA被NMD机制作用的标志。

细胞经常会产生带有PTC的mRNA，这些mRNA一旦翻译成蛋白质，就会导致疾病。含有PTC的转录产物能通过NMD机制被迅速降解，从而阻止有害物质——截短蛋白（truncated proteins）的产生［21］，是生物体保护自身的一种途径。NMD受多种顺式作用元件和反式作用因子调控。

2.1 顺式作用元件 识别异常终止密码子是NMD过程中的关键一步，顺式作用元件在其中起着重要作用，研究表明无义密码子是通过它3'的序列来显示其异常的。

对酿酒酵母研究发现，PTC下游150～200核苷酸处存在下游序列元件 （downstream sequence element，DSE）［22］， 而正常终止密码子则没有该序列，因此能将PTC区分出来。哺乳动物存在着2种对应DSE的序列：一种是fail－safe序列，见于人丙糖磷酸异构酶和β珠蛋白mRNA中；另一种是前体mRNA剪接后产生的外显子－外显子连接 （exon－exon junction，EEJ），即 NMD要求 PTC下游至少存在一个内含子，这样剪切掉该内含子后才能产生EEJ。

与酵母基因不同，哺乳动物基因中存在大量内含子，基因转录多需剪接加工，除可产生PTC外，还可产生相应的EEJ，因此AS对哺乳动物的NMD作用是必需的。

2.2 反式作用因子 NMD同样还要一些相关反式作用因子的参与，其中研究最多的是上游移码突变体（up－frameshift mutant，Upf）［23］。

酵母菌有 3 种 Upf蛋白质：Upf1p、Upf2p、Upf3p， 人体中有 4种 Upf蛋白质：hUpf1p、hUpf2p、hUpf3ap和hUpf3bp。1个或多个Upf基因缺失型的酵母菌株能同等程度地稳定无义突变的mRNA，但对野生型的mRNA的衰变速率无影响［22］。表明Upf蛋白是NMD不可缺少的反式作用因子［24］，且Upf蛋白是以复合物的形式发挥功能的。Upf1p是一种依赖于ATP的RNA解旋酶，在翻译提前终止时与真核释放因子 1（eukaryotic release factor 1，eRF1）和真核释放因子 3（eukaryotic release factor 1，eRF3）结合，起到连接翻译与NMD的作用。Upf2p除了与eRF3相关外，还能结合Upf1p和Upf3p。Upf3p属穿梭蛋白，具有联系mRNA在核内的加工修饰与在胞质中NMD的作用［25］。

酵母的Hrp1p是一种RNA结合蛋白质，可特异结合DSE，起到对无义mRNA进行标记的作用。当Hrp1基因突变时，Hrp1p无法特异结合DSE，致使无义mRNA的稳定性增高，而且Hrp1p与Upf1p及 Upf2p间存在着互相作用［26］。

哺乳动物细胞中，mRNA中EEJ上游20～24个核苷酸处存在着外显子连接复合物 （exon－junction complex，EJC），具有标记无义 mRNA 的作用［27］。EJC由 mRNA穿梭蛋白 Y14、MAGON、eIF4A3和 BTZ四种蛋白组成［28，29］，作为一个稳固的平台用于其他组分的锚定，在NMD中发挥重要作用。

2.3 NMD途径的作用机制 蛋白质表达最后一步是翻译终止，真核细胞中这个过程是在两个蛋白因子调控下完成的：eRF1和eRF3，NMD同样离不开 eRF1 和 eRF3 的参与［30］。

在哺乳动物细胞中，首先Upf3p与EJC相互作用而附着在mRNA上；随后Upf2p通过与Upf3p作用被招募到复合体中。正常mRNA在核糖体开始翻译后，EJC会从mRNA上解离出来，直到核糖体遇到终止密码子后翻译停止，如果在终止密码子后面50～55个核苷酸的位置仍然存在EJC，那么该终止密码子就是PTC，通过释放出eRF1－eRF3复合体，招募结合 Upf1p；在蛋白激酶 SMG－1（suppressor with morphogenetic effect on genitalia－1）的作用下将Upf1p磷酸化。磷酸化的SURF复合体（SMG－1、Upf1p、eRF1和 eRF3）将停滞于PTC 位点的核糖体40 S和60 S亚基解离，从而激活NMD途径。

3 AS-NMD与恶性肿瘤

恶性肿瘤的发生与AS异常密切相关，原癌基因、抑癌基因及肿瘤侵袭和转移相关基因均受到AS调控。原癌基因中Bcl－x的异构体Bcl－xL具有抑制细胞凋亡的作用，在多发性骨髓瘤、小细胞肺癌等多种肿瘤中表达增高。抑癌基因中，前列腺癌中KLF6（Krupple like factor 6）基因的单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP） 增加KLF6的选择性剪接，引起KLF6－SV1和KLF6－SV2异构体在前列腺癌的表达增高，拮抗野生型KLF6的功能，促进肿瘤细胞的生长。与肿瘤侵袭和转移有关的基因中，CD44的选择剪接异构体CD44v5、CD44v6等特异性的与某些肿瘤转移相关，表达阳性的肠型胃癌比CD44v6表达阴性的弥漫型胃癌浸润生长能力增强［31］。

NMD途径能迅速地降解mRNA突变体，NMD异常时就产生很多截短蛋白，从而导致多种恶性肿瘤的产生。例如抑癌基因：BRCA1、p53以及 WT1。在 NMD异常时，这些抗癌基因会产生截短蛋白，使得细胞凋亡减少，最终导致癌变的发生［32］。可见，NMD是一种重要的mRNA转录后监控机制，能够发现和降解无义mRNA，防止其对人体产生危害。

AS与NMD关系密切，两者常相互偶联，形成AS－NMD，对维持基因表达水平的稳态起着重要的作用［33，34］。当体内一种基因表达水平过高时，正常情况下，机体会通过增强AS，将该基因剪接成一个含有PTC的无义mRNA，再通过NMD机制被降解而下调其表达水平，维持基因表达的动态平衡。

综上所述可见，AS与NMD在人类生理病理过程中均起着重要作用。以往研究往往将两者分开，目前人们已认识到两者之间存在着紧密的联系。现越来越多的基因序列分析结果表明AS－NMD在SR蛋白质和hnRNP蛋白质中普遍存在［35］。尤其是近年来RNA结合蛋白PTBP3研究的不断深入［36－39］，Spellman等认为PTBP3作为PTBP1的旁系同源是一种 AS的调节因子［17］，而 Brazao TF等则认为PTBP3则是一种与Upf1类似的NMD相关蛋白［40］，虽然两者观点有所分歧，但可以看出AS与NMD之间联系密切。AS－NMD的具体作用机制尚未完全阐明，进一步研究有助于对恶性肿瘤等疾病发病机制的深入认识，并对诊断和治疗产生深远影响。

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