复方黄栌口服液中总黄酮含量测定方法

郝少君，李文俊，高延玲，苏 峰，张正臣

复方黄栌口服液为临床应用多年的中药制剂，由黄栌、五味子、垂盆草、枸杞、栀子、大枣等六味中药组成。除湿清热，退黄降酶，用于急性黄疸型肝炎，慢性肝炎。文献报道［1］，黄栌所含的黄酮类、多酚类等物质可用于高血压、黄疸性肝炎等的防治；五味子富含黄酮类木脂素、多糖、挥发油及其他多种化学成分，具有保肝益肾、保护心脑血管、镇静、催眠等多种功能［2，3］；垂盆草［4］主要含有糖类、黄酮类、三帖类及苷类成分，垂盆草总黄酮［5］是垂盆草中重要的保肝降酶活性成分之一，且垂盆草总黄酮至少含有槲皮素、山柰素、木犀草素等8种黄酮类化合物；宁夏枸杞［6］的主要活性成分含量——枸杞多糖、总糖、甜菜碱；栀子［7］的化合物有环烯醚萜类、黄酮类、有机酸酯类、多糖类、醛类、醇类、长链烷烃类等；大枣［8］主要成分为糖类、有机酸及其酯类、皂苷类、生物碱类、黄酮类等。

以上可知，黄酮类成分为方中的主要有效成分。该文以芦丁为对照品，利用黄酮类化合物的3，5－羟基与Al3+生成络合物，在可见光区有最大吸收的特点，采用紫外分光光度法［9－14］测定黄酮的含量，为建立该复方黄栌口服液的质量标准提供了理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 752N紫外可见分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）；AB135－S电子天平 （梅特勒－托利多集团）。

1.2 试药 芦丁对照品 （批号：100080－201409 CAS号：153－18－4）购自中国食品药品检定研究院；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。复方黄栌口服液（批号：20150608、20150712、20150820）由该院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品50 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加70%乙醇20 ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得对照品溶液（每1 ml含芦丁0.2 mg）。

2.2 供试品溶液的制备 精密量取复方黄栌口服液5 ml，置 50 ml量瓶中，加70%乙醇40 ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 检测波长的选择 精密量取对照品溶液1 ml，置于25 ml容量瓶中，加水5 ml，加入5%亚硝酸钠溶液1 ml，摇匀，放置6 min，后加入10%硝酸铝溶液1 ml，混匀，放置6 min，再加入10 ml氢氧化钠试液，加水至刻度，摇匀，放置15 min，同时以相应的试剂做空白对照，照紫外－可见分光光度法，测定波长在400～600 nm区段内的吸光度，结果在505 nm波长处有最大吸收，因此选定510 nm为检测波长。

2.4 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分别置 25 ml量瓶中，各加水至6.0 ml，加 5%亚硝酸钠溶液1 ml，混匀，放置6 min，加 10%硝酸铝溶液 1 ml，混匀，放置 6 min，加氢氧化钠试液（取氢氧化钠4.3 g，加水使溶解成100 ml，即得）10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min；以相应的试剂为空白，照紫外－可见分光光度法，在505 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=9.5385C+0.097（r=0.9997），表明芦丁在8～48 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5 总黄酮含量测定 精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照“标准曲线的绘制”项下的方法，自“加水至6.0 ml”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算即得。平行测定3次，结果三批复方黄栌口服液的总黄酮含量平均为32.75 mg/ml。结果见表1。

表1 复方黄栌口服液中总黄酮的含量测定（n=3）

2.6 精密度试验 精密量取同一批 （批号：20150820）样品供试品溶液2 ml，按照“标准曲线的绘制”项下方法，自“加水至6.0 ml”起依法测定吸光度A值，平行测定5次。结果见表2。表明本方法精密度良好。

表2 复方黄栌口服液的精密度试验（n=5）

2.7 稳定性试验 取供试品溶液（批号：20150820）2 ml，按照“标准曲线的绘制”项下方法，自“加水至6.0 ml”起，依法显色后放置不同时间进行测定，每隔5 min测定1次吸光度。结果见表3。

表3 复方黄栌口服液的稳定性试验结果

结果测得的RSD值为0.64%，表明供试品溶液在30 min内稳定。

2.8 重复性试验 取复方黄栌口服液样品，分别精密量取本品5 ml，共5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.5”项下方法，依法显色后测定总黄酮含量，结果RSD为1.67%，表明该方法的重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取已知含量的供试品溶液（0.3184 mg/ml）共 6份各 1 ml，分别精密加入不同量的对照品溶液（0.2 mg/ml），照“标准曲线的绘制”项下的方法，自“加水至6.0 ml”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算回收率。结果见表4。

表4 加样回收率试验结果

结果该方法的平均回收率为99.38%，RSD为1.57%。

3 讨论

甲、乙、丙型肝炎损害肝功能、危及生命、易引起并发症，是法定乙类传染病，具有传染性较强、传播途径复杂、流行面广泛、发病率高等特点。目前虽然有一些中、西药治疗方式，但是疗效仍不理想，不能较好的治疗各型肝炎且有不同程度的不良反应，给患者带来较大的痛苦。西药虽见效快，但不良反应大，亦有导致中断治疗的现象。鉴于此根据多年的临床实践经验，该方剂由笔者所在医院药械科与肝病科合作，研制了复方黄栌口服液，方由黄栌、五味子、垂盆草、枸杞、栀子、大枣等六味中药组成。

方中黄栌［15，16］清热解毒，散瘀镇痛，具有抗菌消炎、退热消肿等功效，含有黄酮、没食子酸等多种化学成分，也是我国传统药用植物，可用于治疗黄疸型肝炎、水火烫伤、感冒、牙龈炎，为君药。五味子［17］可敛肺滋肾，生津敛汗，涩精止泻，宁心安神，降低血清转氨酶，保肝利胆，能增加机体对非特异性刺激的防御能力；垂盆草具有清热解毒、清利湿热的功效，有文献报道垂盆草有保肝降酶的作用，并证实了垂盆草的保肝降酶的主要活性成分存在于苷类和总黄酮，而垂盆草颗粒是由鲜垂盆草经提取、制粒制备而成的中成药，用于急慢性肝炎湿热瘀结证，以上二味药为臣药。枸杞子能补血明目，为滋阴助阳，益精补血之良药；栀子［18］具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒的功效，主治热病心烦，肝火目赤，头痛，湿热黄疳，药理作用表明栀子具有抗氧化、抗炎、抗自由基损伤、促进胆汁分泌、抗病毒、保护神经细胞等作用，以上二药为佐药。大枣可补中益气，养血安神，缓和药性，有提高体内单核－吞噬细胞系统的吞噬功能，保护肝等作用，为使药。诸药合用，以达到除湿清热、退黄降酶的作用，用于急性黄疸型肝炎，慢性乙型肝炎。

该实验首次从复方黄栌口服液中提取出总黄酮并测定了其含量，为建立该制剂的质量标准提供了理论依据。结果表明，利用紫外分光光度法对复方黄栌口服液中总黄酮含量进行测定，实验条件容易控制，操作简单，重现性好，可作为测定黄酮类化合物的常用方法。

在该实验中采用硝酸铝作为黄酮类物质比色测定的显色剂，主要是因为黄酮母核中含有碱性氧原子，一般又多带酚羟基，能和铝离子产生黄色络合物。加入亚硝酸钠和氢氧化钠，可使之在碱性溶液中显红色，显色反应要及时测定，放置过久易褪色。

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