提高血凝与血凝抑制试验检测精确率的探讨

刘 伟

福建省石狮市动物卫生监督所 福建石狮 362700

提高血凝与血凝抑制试验检测精确率的探讨

刘 伟

福建省石狮市动物卫生监督所 福建石狮 362700

血凝与血凝抑制试验作为多种动物疫病抗体检测的手段，在基层动物疫病预防控制机构检测工作中被广泛应用，同时在疫病监测、免疫状态评价、流行病学调查以及群体诊断中都具有重要的意义。因此，总结分析血凝与血凝抑制试验，提高检测精确率，避免出现错误结论就显得尤为重要。文中从影响HA、HI试验检测结果的因素出发，分析总结提高检测精确率的方法，供大家参考。

血凝与血凝抑制 禽流感 新城疫

1 缓冲液

1.1 缓冲液的种类 血凝和血凝抑制试验所涉及的试验不同，使用的缓冲液有所区别。常见的缓冲液有生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）。

浓度85%的生理盐水常被用作禽流感抗体检测的缓冲液，盐浓度超过85%易使红细胞受到非特异性凝集，而生理盐水缓冲液不具备维持反应系统pH值的能力，而PBS却具备该项功能。使用PBS进行禽流感抗体检测所测得的抗体效价比使用生理盐水测得的要高，能提高检出率[1]。所以，禽流感HA、HI试验尽量使用磷酸盐缓冲液，可提高检出率，避免出现非特异性凝集。通常配置PBS使用的Na2HPO4含有水分子，此时应注意用量，同时灭菌后还要再次进行pH值的调整。

PBS也常作为新城疫抗体检测的缓冲液。但使用pH值为5.8～6.2的PBS，会导致红细胞自凝和出现凝集图像不清晰的结果。使用pH值5.8～7.2的PBS没有使用同一pH值生理盐水的效果好，生理盐水不会出现自凝、图像不清等缺点[2]。因此，可把生理盐水作为缓冲液进行新城疫抗体检测。

1.2 缓冲液的pH值 无论是哪一种缓冲液，pH值都必须限定好适用范围。病毒血凝性的最适pH值在6.0～7.2。使用PBS时，pH值小于5.8，红细胞可发生聚集结块或破裂溶血，pH值大于7.8，聚集的红细胞会加速解聚，病毒会轻易地从吸附的红细胞上脱落；使用生理盐水时，如果pH值小于6.4或大于7.2，红细胞可能破溃溶血[3]。 综上所述，6.0＜pH＜7.2是PBS进行试验最适合的范围，6.4＜pH＜7.2是生理盐水进行试验最适合的范围。因此，为了避免对试验结果的误判，缓冲液的pH值可统一限定在6.4～7.2，而pH值在7.0～7.2时，血沉最充分，图像辨识度最高，观察也最简单，结果判断也最准确[4]。同时考虑pH计或pH试纸的误差，可把缓冲液的pH值设在7.0，这也在长期的检测工作中得到有效验证。

1.3 缓冲体系的统一 试验过程中每一个步骤都必须使用同一种缓冲液，保证缓冲体系一致，尤其是在配制1%鸡红细胞时，切不可为了方便使用生理盐水，而应该依据试验所需的缓冲体系进行操作。

2 温 度

温度在4～37℃时，每提高5℃，HI效价平均上升0.35log2[5]。当环境温度不高于4℃时，不仅反应慢以至需要延长反应时间，而且红细胞会发生聚集；环境温度高于37℃及以上时，抗原能释放神经氨酸酶，破坏红血球表面，从而使之失去聚集能力从红血球上脱落，红血球则血沉过快同时更容易发生溶血，温度过高还面临液体蒸发过快导致反应体系总量和各组分比例失调的后果，这都会导致抗原活性下降，从而使得试验不成立。试验最适宜的温度范围在18～22℃[6]，试验开始前尤其是夏季应把环境温度平衡到该范围。

3 时 间

3.1 HA试验的有效时间和判定 测定血凝效价后不能继续做HI试验的情况有：隔天进行HI试验、更换了红细胞悬液、更换了抗原，这三种情况都必须重新测定血凝效价。HA试验一般在加入红细胞20 min后，随时观察结果，直到对照孔100%凝集，空白对照孔中液体澄清透亮，再进行结果判定。

3.2 HI试验的孵育时间和判定 HI试验的孵育时间与孵育温度成反比，试验最适宜的温度是18～22℃，在该温度范围内，孵育20～40 min。若孵育时间短，血清中的抗体与抗原反应不彻底，凝集不完全，且之后红细胞会与血清中的抗体竞争抗原；若孵育时间长，抗原会释放神经氨酸酶，使凝集的红细胞脱落或红细胞裂解。所以，孵育20 min后，以阴性对照孔完全沉淀、阳性对照孔凝集为信号，随时观察结果。泪滴完全流淌，且以与对照孔泪滴大小、泪痕线粗细、泪痕流速快慢相近的最后孔为判定结果[7]。

4 红细胞

4.1 红细胞的采集 通常情况采集1羽禽的红细胞可能出现自凝，所以一般采集至少3羽无免疫、健康禽的抗凝血液。采集时，抗凝剂使用过少，血液会凝集成块，导致出现凝集价低、凝集抑制价高的误判；抗凝剂使用过多，会抑制凝集，导致出现凝集价高、凝集抑制价低的结果。抗凝剂与血液的最佳比例是（1∶4）～（1∶5）[7]。 条件允许的情况下，可以使用含柠檬酸钠抗凝剂的一次性真空采血管，以提高检测的精确性。

4.2 禽种的选择 检测禽类血清抗体时，用同种禽类红细胞基本上不出现非特异性凝集；检测水禽血清抗体时，用鸡红细胞就可能出现非特异性凝集，出现假阴性[4]。因此，检测禽类血清抗体时最好采集同种禽类的血液。

4.3 红细胞的洗涤 在基层工作中我们很难判断采集红细胞的禽类是否健康和有无免疫，因此，采集来的血液要适当增加洗涤次数，以洗去血清中固有的抗体和杂质。采集的3份红细胞可先分别进行3次洗涤，尽量洗去白细胞膜，然后把洗涤好的3份红细胞进行混合，再进行洗涤，洗涤次数不宜过多，离心转速按标准文件设定，直至上清液澄清、透明即可。离心管有“U”型和“V”型两种，最好选择后者，因为前者会使红细胞沉淀不完全，导致洗涤效果不好。有的红细胞血沉较慢，会导致试验结果误差很大，因此，制备好的红细胞，一定要先观察血沉，血沉过慢的应当重新制备[8]。

4.4 红细胞的配制 去除红细胞离心管的上清液后，吸取X mL缓冲液加入到红细胞泥中，充分混匀后回抽（X+Y）mL，这时回抽液中就含有Y mL红细胞，就可以配制出（100×Y）mL的1%红细胞悬浊液，0.5%的红细胞悬浊液以此类推。根据检测样品数就可以推算出需要回抽多少毫升的红细胞。

5 抗 原

目前基层使用的抗原基本上都是冻干粉，所以，抗原方面只需要做好抗原效价的测定以及抗原效价的返滴定即可，返滴定可对不准确的效价进行校正。按照测定的抗原效价，进行效价±1共三种梯度的返滴定，选取使1单位抗原完全凝集、1/2单位抗原完全抑制的抗原梯度作为配制4单位抗原的效价。由于冻干粉原液中的各种成分依然存在于冻干粉中，所以，配制抗原用灭菌水稀释冻干粉就可以了，否则可能导致抗原盐类浓度过高，出现盐类凝集、抗原效价不准确等现象。

6 操 作

试验操作时吸头要压实紧密，指压力度要均匀，吹打要慢吸快注，避免气泡和溢出，同时要避免吸头与反应板底部摩擦，造成的底部磨损会导致泪滴流淌不顺畅、图像不清晰。样品、阳性血清、抗原和红细胞悬液在使用前要摇匀，加入红细胞反应后要使用振荡器平稳、匀速振荡混匀，时间在10 s左右即可。加红细胞时，从最后一孔向前加，可以平衡各孔的反应时间。要避免把反应板放在空调出风口的方向上，以免反应体系的液体蒸发过快。

[1]许连珍.HA、HI微量法检测鸡群抗体的影响因素[J].中国家禽,2006,28(18)：31-32.

[2]张波,阎红,庄艳.实验室操作过程中影响血凝抑制试验的因素[J].现代畜牧兽医,2006(10)：44.

[3]闫玲.几种试验条件对鸡新城疫血凝和血凝抑制试验的影响[J].黑龙江畜牧兽医1995(6)：25-26.

[4]杭柏林,胡建和,刘丽艳,等.影响血凝抑制试验因素的研究进展[J].贵州农业科学,2009,37(3)：111-113.

[5]雷莉辉.影响血凝试验和血凝抑制试验的因素分析[J].中国畜牧兽医,2013,40(6)：244-246.

[6]杨文,孙文梅,江燕萍.HI试验中应注意的问题[J].上海畜牧兽医通讯,2002(3)：31.

[7]宋建国,周峰.影响血凝和血凝抑制试验因素的探讨与分析[J].国外畜牧学猪与禽,2015,35(10)：59-61.

[8]黄愉森,庄克,谢淑敏.不同种禽类红细胞悬液对HI结果的影响[J].养禽与禽病防治,2005(1)：8-9.

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1003-4331（2017）06-0034-02