乳腺癌组织中RBM24的表达及其预后分析

曾嘉毅 刘志华 陈菲 苏士成*

乳腺癌组织中RBM24的表达及其预后分析

曾嘉毅1#刘志华2#陈菲3苏士成3*

目的探讨乳腺癌组织中RNA结合蛋白24（RNA-binding protein 24，RBM24）的表达及其预后分析。方法收集中山大学孙逸仙纪念医院手术切除并由病理确诊的乳腺癌及癌旁正常组织标本各24例，通过RT-PCR和Western blotting检测RBM24的表达，同时结合TCGA数据库，判断RBM24的表达与患者预后的关系。结果乳腺癌组织中的RBM 24mRNA和蛋白水平明显低于癌旁组织（P＜0.001）。同时K-M法分析显示RBM24阳性的乳腺癌患者5年生存期（OS）高于阴性患者（P＜0.05）。结论RBM24在乳腺癌中低表达，并且与乳腺癌患者的预后密切相关，因此可作为判断乳腺癌预后的一个重要参考指标。

乳腺组织；RNA结合蛋白24；预后

近年来乳腺癌发病率明显增加，是女性最常见的恶性肿瘤之一，也是女性最常见的致死原因之一［1］。虽然治疗乳腺癌患者的水平得到了大幅度提高，但国内乳腺癌的死亡率仍呈现增高的趋势，增幅高达67.8%［2］。乳腺癌的治疗与预防在于乳腺癌的早期诊断，然而由于其发病隐匿，早期临床症状不是很明显，容易被患者及医生忽视。因此，寻找能早期诊断，治疗及预防的分子标记物是进一步改善乳腺癌患者预后的重要目标。

RNA结合蛋白（RNA-binding protein）在转录后基因表达调节中起着重要的作用，它通过和RNA相互作用来调节细胞的功能。该类蛋白参与RNA剪接、多聚胸苷化作用、序列编码、RNA转运、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译调控等。RBM24是一种具有与RNA结合的保守结构的RNA结合蛋白，该蛋白在心脏和骨骼肌肉组织中有明显的表达，同时在肌原性的分化和心脏发育中起着重要的作用。最近的研究也表明，在人类癌症细胞系中，它可以在转录水平上调节p21和p63的稳定性［3］，同时在鼻咽癌中发现RBM24通过上调miR-25来抑制肿瘤的进展［4］。目前RBM24在乳腺癌的研究尚未报道，本研究通过RT-PCR和Western-blotting联合检测RBM24在mRNA及蛋白在乳腺癌组织中的表达，同时通过结合TCGA数据库，探讨RBM24在人类乳腺癌的发生发展中所起的作用及临床意义，为进一步探讨乳腺癌的发生发展的分子机制提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象收集2009年2月至2013年7月间，中山大学孙逸仙纪念医院乳腺中心的手术切除乳腺癌组织及距离癌灶5 cm以上癌旁正常组织共24对，年龄33～45岁。经术后病理检查证实为乳腺癌，新鲜标本放入液氮后存放于-80℃保存。所有病例均征得患者同意并签署相关同意书。

1.1.2 数据资料收集利用Bioconductor/TCGAbiolinks函数包从TCGA数据库（https：//gdc-portal. nci.nih.gov/）下载并预处理乳腺癌数据集的mRNA表达RNASEqV2数据。

1.1.3 主要试剂主要试剂：兔抗人RBM24多克隆抗体（Abcam公司，英国），总RNA提取试剂盒Trizol（sigma公司），反转录试剂盒（Promega公司，美国），RBM24基因和内参β-actin基因的特异性引物由广州市睿博兴科生物技术有限公司合成，其中RBM24上游为CCAAGGATCATGCAACCAG，下游为GCAGGTATCCCGAAAGGTCT，β-actin上游为AGCCTCGCCTTTGCCGATCC，下游为ACATGC CGGAGCCGTTGTCG。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取用液氮研磨法将24对新鲜乳腺癌组织磨成粉末，加入Trizol，按照Trizol裂解抽提组织中总RNA，一般100～200mg组织加入1mL Trizol。，通过紫外分光光度计测定总RNA的浓度，同时计算A260/A280值检测RNA纯度。

1.2.2 实时定量RT-PCR检测组织中RBM24的mRNA的表达在测定RNA浓度后，取等量RNA模板加样，使用反转录试剂盒将RNA反转录扩增为cDNA。然后采用SYBR greenⅠ染料，在ROCHE 480 Real-time PCR仪上进行实时定量PCR。以βactin为内参照，采用行对定量法计算。

1.2.3 乳腺癌及癌旁组织中RBM 24蛋白的表达按照总蛋白试剂盒（p1250，总蛋白提取试剂盒，普利莱基因技术有限公司）提供的程序从21对新鲜冷冻组织中提取总蛋白。通过BCA法检测蛋白浓度后，取等量蛋白加入上样缓冲液并煮沸变性，采用15%SDS-PAGE分离胶，5%SDS-PAGE浓缩胶。取30μg蛋白样品加入上样孔，先以70 V恒压电泳，待样品进入分离胶后将电压调至100 V，至目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm以上停止电泳。再用200mA恒流，2 h转膜。转膜后将PVDF膜浸入封闭液中1 h，加入1∶1000 RBM24抗体放置在摇床上4℃过夜。次日回收一抗，洗膜3次，后加入1∶3000二抗，室温孵育45min，洗膜3次用Bio-Rad成像系统显影。

1.2.4 统计学处理使用SPSS 16.0软件进行统计学分析。应用Paired t test检验RBM24在乳腺癌和癌旁组织中mRNA的表达水平。关于预后的判断采用Kaplan-Meier生存分析。检验水准α取0.05，P＜0.05表示具有统计学差异。

2 结果

2.1 RBM24基因在癌组织和癌旁中mRNA的表达

使用实时定量RT-PCR对24对乳腺癌患者组织中检测RBM24的含量，结果提示RBM24mRNA

在乳腺癌组中的表达水平明显低于癌旁正常组织，表达具有统计学差异（P＜0.001，图1）。

图1 RBM 24在乳腺癌组织中和对应癌旁组织中的相对表达量***P＜0.001

2.2 RBM24蛋白Western blotting检测结果

通过Western blotting检测了21对乳腺癌及其癌旁组织中RBM24的蛋白表达水平，结果显示，与癌旁组织性比，乳腺癌组织中RBM24的表达水平明显低于癌旁组织，表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。其中11对乳腺癌及其癌旁组织中RBM 24的Western Blotting如图所示（图2）。

图2 RBM 24蛋白在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达

图3 RBM 24m RNA高表达组与低表达组生存曲线（Kap lan-M eier法）

2.3 RBM24相对表达量与乳腺癌患者预后的关系

从Bioconductor/TCGAbiolinks函数包从TCGA数据库（https：//gdc-portal.nci.nih.gov/）下载并利用R语言（Deseq和edgeR程序包）对853例浸润性乳腺癌（随访时间为5年）预处理，对样本的RBM24的mRNA表达水平进行了ROC曲线的分析，将数据分为两等分，以RBM24的表达水平的中位数145.3为界，低于中位数节点的样本为低表达组，而高于该中位数的为高表达组。Kaplan-Meier生存分析提示：RBM24表达与患者的5年生存时间（OS）呈明显负相关，即RBM25高表达患者的5年生存时间明显高于RBM24低表达者，差异具有统计学意义（P=0.0018，图3）。

3 讨论

RNA结合蛋白（RNA binding proteins，通常缩写为RBPS）是一种在细胞内与双或单链RNA结合并且参与形成核糖核蛋白复合物的蛋白。该类蛋白包含各种结构域，如RNA识别序列（RNA recognition motif，RRM），双链RNA结合域，锌指结构等等［5］。目前有研究表明RNA结合蛋白在线虫的早期胚胎发育中起着重要的作用［6］，此外，RBPS的出现在肿瘤发展中起着至关重要的作用［7］。在不同的癌症中，检测到了许多RBPS的异常表达，如乳腺癌CELF3，肝癌RBM24，和肺癌IGF2BP2/3等等，尽管RBPS在基因表达的转录后调控的起着如此重要的作用，但很少有对其进行系统的研究。

RBM24是一种RNA结合蛋白，目前对该基因的研究很少。近年来的研究表明在人和小鼠的胚胎干细胞分化成心肌细胞的过程中，RBM24上调［8］。同时也有研究证实，RBM24的同源体最先在斑马鱼、青蛙、小鼠胚胎的心脏前体中表达，然后再分化的心肌中表达。在敲低RBM24后将会导致斑马鱼胚胎肌节蛋白的减少，肌原纤维的降解，进而导致心率改变和血流量的减少［9］。最近的研究发现RBM24能结合到p63的3′UTR，导致p63转录子发生降解，该蛋白中的RNA结合区域是RBM24与p63结合所必须的，并能抑制p63的表达［10］。同时也有研究表明，RBM24通过与p21的3′UTR区域结合，调节mRNA的稳定性，从而增加p21的表达［11］。P53结合到RBM24基因的启动子上，通过启动子上的p53应答原件转录调控RBM24。同时RBM24通过与p21的3′UTR区的ARE结合，进而维持了p21的转录活性。目前在肿瘤中对该基因的研究知之甚少，因此本研究收集手术切除乳腺癌及癌旁正常组织，进行Western blot和RT-PCR检测，结果提示RBM24mRNA和蛋白在乳腺癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织，经过统计学处理分析具有统计学意义。同时通过结合TCGA数据库的临床数据分析，进一步发现RBM24与乳腺癌患者的预后呈负相关，因此可以认为RBM 24在判断乳腺癌的临床预后中具有一定的指导意义，这也提示RBM24表达可能与乳腺癌的发生发展密切相关。但是对于该基因的分子机制有待进一部的研究。

本研究的不足之处在于，TCGA数据库提供的是mRNA水平的数据，有可能无法完全代表RBM24的蛋白水平表达情况，在后续的研究中要结合免疫组化的方法进一步研究该基因与临床病理的生物学行为的关系。同时本研究为后续关于RBM24在其他肿瘤中的基础研究和临床研究提供了线索和依据，需要进一步的研究和探讨RBM 24的作用机理，为肿瘤的治疗提供新思路。

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Expression of RNA-binding p rotein 24 and its association with prognosis in breast cancer

ZENG Jiayi1*，LIUZhihua2*，FEIChen3，SU Shicheng3.
1GuangzhouZhi-xin High School；2Sun Yat-sen University Cancer Center；3Sun Yat-sen Memorial Hospital，University，Guangzhou 510120，China.Correspondine author:SU Shicheng，seasonso@163.com

ObjectiveTo explore the expression of RNA-binding protein 24 and its prognostic significance in breast cancer.MethodsTwenty-four pairs of breast cancer tissues and paraneoplastic breast tissueswere collected.ThemRNA and protein of RBM24 in these tissue sampleswere detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）and western blotting.Meanwhile，we examined the clinical significance of RBM24 in breast carcinoma using TCGA data.ResultsThemRNA and protein of RBM24 was significantly higher in the paraneoplastic breast tissues than in the breast cancer tissues（P＜0.001）.Kaplan-Meier univariate survival analysis suggested that high RBM 24 expression was associated with poor overall survival（P＜0.05）.ConclusionRBM24 was downregulated in breast cancer，which was associated with poor prognosis.Therefore，RBM24may serve as a prognostic biomarker for breast cancer.

breastcancer；RNA-binding protein 24；prognosis

R737.9

10.3969/j.issn.1009-976X.2017.01.007

2016-12-23）

国家自然科学基金面上项目（81372816）

1510080广州广州市执信中学；2510060广州中山大学肿瘤防治中心；3510120广州中山大学孙逸仙纪念医院乳腺癌医学部

#同等贡献

*通讯作者：苏士成；Email：seasonso@163.com