抑制miR-223表达促进巨噬细胞的M2型激活

杨丽美姚和瑞刘玉洁*

抑制miR-223表达促进巨噬细胞的M2型激活

杨丽美1姚和瑞2刘玉洁2*

目的观察microRNA-223（miR-223）在巨噬细胞M2型激活中的表达及作用。方法运用慢病毒载体感染的方式在巨噬细胞中过表达或敲低miR-223的表达；应用qPCR检测不同激活状态及转染状态巨噬细胞中miR-223的表达；应用Elisa及流式细胞术检测M2型巨噬细胞的激活状态；应用Transwell迁移实验和划痕实验检测乳腺肿瘤细胞的迁移情况。结果miR-223在单核/巨噬细胞中的表达明显高于肿瘤细胞，在单核细胞向巨噬细胞分化过程中miR-223表达下调，且IL-4或与肿瘤细胞共培养激活的巨噬细胞下调显著。敲低miR-223的表达而不是增加其表达能够促进M2型巨噬细胞标记物CCL18、IL-10和CD206的表达，并促进共培养肿瘤细胞的迁移。结论miR-223可作为靶向肿瘤微环境调控肿瘤转移的靶点。

microRNA-223；巨噬细胞；乳腺肿瘤

0 前言

乳腺癌已经成为威胁女性生命健康的首位恶性肿瘤。特别是对于中晚期的病例，即使经过根治性的手术治疗，多个疗程的放疗、化疗和内分泌治疗，仍有相当大部分病人会发生复发和远处转移，危及生命。因此，探讨乳腺癌的侵袭和转移机制已成为目前研究的热点之一。

实体肿瘤组织由肿瘤细胞和许多非肿瘤的间质细胞组成，这些细胞连同血管淋巴管构成肿瘤的微环境。在肿瘤微环境中这些细胞相互作用从而影响着肿瘤的生长、进展、转移和血管生成［1］。其中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages，TAMs）在肿瘤进展中的重要作用近年来已得到广泛共识，在乳腺癌中，TAMs占到细胞组分的50%以上，并且80%的临床研究显示TAMs的密度与肿瘤的不良预后呈正相关［2］。在肿瘤组织中，根据局部组织微环境中存在的因子不同，巨噬细胞呈现不同的激活状态或表型。细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）或干扰素γ（interferonγ，IFN-γ）可诱导巨噬细胞的“经典激活”，呈现M1表型，表达高水平的促炎因子和MHCⅡ，能够杀死微生物和肿瘤细胞。而TH2细胞因子，例如白介素-4（interleukin4，IL-4）和IL-13，促进巨噬细胞进入“选择性激活”途径，呈现M2表型，通过产生血管生成因子，基质分解因子和下调抗肿瘤免疫反应等从而促进肿瘤的发展［3，4］。

MicroRNA（miRNA）是在真核生物中发现的一类具有内源性调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。MiRNA通过部分碱基互补配对的方式，识别靶mRNA的3′UTR，并指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译［5］。越来越多的证据表明microRNA能转录后调控多项细胞生物学特性，从而决定细胞命运。已有研究发现LPS能诱导巨噬细胞内多种miRNAs的表达，参与M 1型巨噬细胞的促炎反应［6］。虽然miRNA在M1型巨噬细胞激活中的作用已有定论，然而，microRNA是否也在IL-4/IL-13促进的M2型巨噬细胞激活中发挥作用，目前的研究还较少［7］。

MiR-223是一种高度保守的miRNA，几乎专一性地在髓系细胞中表达［8］。我们前期研究发现，巨噬细胞能够通过分泌外泌体（exosome）的方式将miR-223包裹其中并传递到乳腺肿瘤细胞中，通过靶向肿瘤细胞中的Mef2c-β-catenin通路，促进肿瘤细胞的转移［9］。本研究结果及前期研究均发现miR-223在单核/巨噬细胞中高表达，那么miR-223是否在巨噬细胞的激活中发挥作用，目前还没有定论。因此，本研究旨在体外探索miR-223对巨噬细胞激活状态的影响，及对肿瘤转移功能的调控。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自ATCC；RPMI-1640培养基、DMEM培养基、0.25%胰酶、胎牛血清（Fetalbovine serum，FBS）购自life technology；CCL18、IL-10 Elisa试剂盒购于ebioscience公司；CD206-FITC及其同型抗体购于BD公司；0.4μm及8μm transwell小室购自Corning；携带miR-223 mimics、inhibitor及NC的慢病毒载体病毒液购自上海吉玛；qPCR试剂盒购自Takara；Trizol购自life technology；Tumor dissociation kit购自美天旎，CompomatG4全自动血液成分分离机购自德国费森尤斯。

1.2 细胞培养

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SK-3rd、BT-474应用DMEM+10%胎牛血清培养，置于37℃含5%CO2的培养箱中。

人外周血单核细胞（human peripheral blood monocyte cells，PBMC）分离方法参考之前文献报道［10］等。血液标本选择广州血液中心采集的献血者400mL四联袋全血，进行以下操作：①接驳；②血液的初次离心和分离：将四联袋采集的新鲜（4～6 h内）400mL全血，以2100 g、12min、22℃为离心条件，进行重离心，离心后的血袋置于CompomatG4全自动血液成分分离机上，按照预先编制的程序，自动分离含血小板的血浆，分离完毕，机器自动将红细胞血浆热合封口；③将分离出的含血小板的血浆袋室温悬挂静置1～1.5 h；④含血小板血浆进行第2次离心和分离：将静置后含血小板和空转移袋的二联袋，以400 g、8 min、22℃为离心条件进行轻离心（Sorval1.RE-12BP型离心机）；⑤用分血夹板通过虹吸法缓慢分离出上层血浆（含血小板），下层即为制备的白膜层（白细胞）。将白膜层吸出，重悬于无血清RPMI-1640培养基中，以5×106细胞/孔的密度种于24孔板中，1 h后去掉悬浮细胞，加入RPMI-1640完全培养基。所获得细胞95%以上为CD14+细胞，即为单核-巨噬细胞（此部分结果未显示，参考前期实验结果［9，11，12］）。未激活的巨噬细胞（Con mac）继续在RPMI-1640完全培养基培养，LPS激活的巨噬细胞（LPS mac）在培养基中加入LPS（25μg/mL），IL-4激活的巨噬细胞（IL-4 mac）在培养基中加入IL-4（45 ng/mL）培养4天。MDA-MB-231细胞与巨噬细胞共培养（Cocu）应用0.4μm transwell小室，将巨噬细胞置于上室，肿瘤细胞种于下室。MiR-223 mimics、inhibitor及其NC采用慢病毒载体感染巨噬细胞。

人原代TAMs从原代切除的乳腺肿瘤组织中分离。分离方法采用美天旎公司Tumordissociation kit及gentleMACSTMDissociators仪。操作步骤参考说明书，肿瘤组织消化后获得的细胞悬液同上应用淋巴细胞分离液分离TAMs，95%以上细胞表达CD14。

1.3 qPCR

细胞总RNA提取采用Trizol提取，miR-223及内参照U6 snRNA引物由上海吉玛合成。qPCR过程参考试剂说明书。实验中使用的引物序列如下：

miR-223上游引物：5CATTGTCAGTTTGTCAA ATACC3′；

miR-223下游引物：5′CCATGAGAGATCCCTA GCG3′；

U6 snRNA上游引物：5′ATTGGAACGATACAG AGAAGAT3′；

U6 snRNA下游引物：5′GGAACGCTTCACGAA TTT3′。

1.4 Transwell细胞迁移和划痕实验

MDA-MB-231细胞80%融合后胰酶消化，PBS冲洗后用100μL无血清培养基重悬1×105细胞，并置于8μm transwell上室，同时下室加入500μL不同处理组巨噬细胞作为趋化剂来诱导细胞迁移。继续培养5 h后，擦掉小室上层细胞，PBS冲洗掉细胞碎片后，用4%多聚甲醛固定20min，然后0.1%结晶紫染色，200倍光学显微镜下拍照并随机取10个视野计数。实验独立重复三次。

在划痕试验中，按照上述共培养方法，将MDA-MB-231细胞置于下室，80%融合后划线，PBS轻轻冲洗掉细胞碎片，然后加入无血清DMEM继续培养12 h，同时上室加入不同处理巨噬细胞。划痕后0 h和12 h分别在显微镜下相同位置拍照。

1.5 Elisa

IL-10和CCL18的表达通过Elisa实验检测。实验操作参考试剂说明书。细胞因子的绝对浓度通过绘制标准曲线计算。实验独立重复三次。

1.6 流式细胞术

巨噬细胞表面标记物CD206的表达情况通过流式细胞术检测。巨噬细胞通过不同处理后，消化收集细胞沉淀，冷PBS冲洗后离心，50μL PBS重悬并加入5μL CD206-FITC或其同型抗体，冰上孵育30min后，PBS洗两遍，流式细胞仪检测平均荧光密度。

1.7 统计与绘图

Originlab 7.5软件处理数据，不同处理组间差异采用单因素ANOVA方差分析（大于等于三组）和t检验（两组），P＜0.05为差异有统计学意义。Originlab 7.5及Adobe illumistrator CS2软件进行绘图。

图1 miR-223在乳腺肿瘤细胞及不同激活状态巨噬细胞中的表达情况

2 结果

2.1 M2型激活的巨噬细胞中miR-223表达下调

既往研究发现miR-223在髓系细胞中高表达，我们的研究比较乳腺肿瘤细胞株MDA-MB-231、SK-3rd、BT-474及单核细胞中miR-223的表达，发现单核细胞中miR-223的表达较肿瘤细胞高约400倍（图1A）。结果提示miR-223可能在单核/巨噬细胞中发挥重要功能。

根据之前的研究报道，IL-4处理或间质型乳腺肿瘤细胞与单核细胞共培养可将之激活为促肿瘤表型的M2型巨噬细胞［12］，而LPS是经典的M1型巨噬细胞激活因子。我们将新鲜分离的单核细胞分为四组：未处理组，LPS（25μg/mL）激活组，IL-4（45 ng/mL）激活组及肿瘤细胞共培养组，处理四天后检测巨噬细胞中miR-223的表达情况。发现miR-223的表达都有不同程度的降低，但LPS处理组与对照组间无显著性差异，而IL-4处理组和共培养组巨噬细胞中miR-223的表达显著下调（图1B）。为了验证是否M2型激活的巨噬细胞中miR-223表达下调，我们分离乳腺肿瘤患者的外周血单核细胞和同一患者的TAMs，qPCR检测发现在TAMs中，miR-223的表达下调更加显著（图1C）。

2.2 降低miR-223的表达促进巨噬细胞的M2型激活

为了检测巨噬细胞的M2型激活与miR-223表达下调的关系，我们在巨噬细胞中过表达或敲低miR-223。由于巨噬细胞属于较难转染细胞，我们采用慢病毒感染的方法，能够较好的增加或降低miR-223的表达（图2A）。然后我们检测增加或降低miR-223的表达对巨噬细胞的激活状态的影响。由于miR-223主要在M2型巨噬细胞中表达下调，我们分别采用Elisa的方法检测M2型巨噬细胞分泌的细胞因子CCL18和IL-10，并用流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面标记物CD206的表达。结果发现，过表达miR-223与其NC相比不增加CCL18，IL-10及CD206的表达，而感染了miR-223 inhibitor的巨噬细胞CCL18，IL-10及CD206的表达上调。应用IL-4处理后，这些因子表达都显著上调，而miR-223 inhibitor处理组中，CCL18，IL-10及CD206的表达较其对照组进一步上升（图2B，C，D）。这些结果提示单独抑制miR-223的表达能激活巨噬细胞的M2表型，同时应用IL-4后进一步增加M2型标志物的表达。应用miR-223mimics与对照组相比不能显著改变M2型标志物的表达。

图2 miR-223inhibitor促进巨噬细胞的M 2型激活

2.3 抑制miR-223的表达促进共培养肿瘤细胞迁移

我们之前的研究发现IL-4激活的巨噬细胞及TAMs能够促进乳腺肿瘤细胞的转移［11］。我们检测敲低巨噬细胞中的miR-223表达后，对肿瘤细胞移动能力的影响。取相同数量的巨噬细胞分别感染miR-223mimics、inhibitor或其NC，4天后在上室种MDA-MB-231细胞观察肿瘤细胞迁移情况。我们发现巨噬细胞共培养后都能增加MDA-MB-231细胞的迁移能力，而低表达miR-223的巨噬细胞促MDA-MB-231细胞迁移的能力更强（图3）。

此外，我们采用划痕实验进一步证实miR-223 inhibitor感染的巨噬细胞对肿瘤细胞迁移能力的影响。我们发现单独只有MDA-MB-231组，细胞的迁移能力最弱，与巨噬细胞共培养后都能增加乳腺肿瘤细胞的迁移。与Transwell迁移实验一致，巨噬细胞转染miR-223 inhibitor而不是mimics后显著促进划痕伤口的愈合（图4）。这些结果与敲低miR-223促进巨噬细胞的M2型激活相关。

图3 Transwell实验显示miR-223 inhibitor感染的巨噬细胞促进肿瘤细胞迁移

图4 细胞划痕实验显示miR-223敲低的巨噬细胞促进MDA-MB-231细胞迁移

3 讨论

尽管已有较多研究报道了巨噬细胞的激活机制，然而microRNA对这一过程的调控作用，特别是对M2型巨噬细胞的激活作用，目前还不明确。MiR-223是髓系细胞的重要调节因子，对于它参与调控巨噬细胞激活并不意外，但是目前的研究对miR-223调控的方向尚有较多争议。

在单核细胞向巨噬细胞分化过程中，多种microRNA的表达下调，包括miR-15、miR-16和miR-223等［13］，这与我们本研究的结果相一致。我们发现无论是LPS诱导的M1型巨噬细胞激活还是IL-4或肿瘤细胞共培养诱导的M2型巨噬细胞激活，其miR-223的表达都下调，其中M2型巨噬细胞的下调较显著。在IL-4激活的巨噬细胞模型中，Zhou等［14］、Laura等［15］和Viviana等［16］都曾报道IL-4激活的巨噬细胞中miR-223表达下调。此外，本实验室前期的研究发现IL-4激活的巨噬细胞能够分泌较多的miR-223通过exosome包裹传递到肿瘤细胞，这个结果从侧面说明由于miR-223大量分泌到巨噬细胞外，导致M2型激活的巨噬细胞中miR-223表达降低［9］。然而，有部分研究发现M2型激活的巨噬细胞中miR-223的表达较M1型巨噬细胞上调，这些不一致的原因主要来自于所观察细胞的来源不同，miR-223表达上调的巨噬细胞主要来自于小鼠骨髓细胞。其次，IL-4处理的时间和浓度不同。TAMs代表着促进肿瘤进展的巨噬细胞类型，有研究认为其为M2的表型，最近也有学者主张不用M1，M2来界定巨噬细胞的激活状态，其原因在于TAMs由于受到肿瘤微环境的影响，其表面标志物及细胞因子的表达更加复杂。相比较单纯IL-4激活的巨噬细胞，TAMs代表着更加促肿瘤的状态［17］。我们收集临床患者的外周血单核细胞，并与同一患者分离的TAMs相比较，发现miR-223的表达在TAMs中显著下调约10倍，下调幅度超过IL-4激活的巨噬细胞。这些结果显示miR-223的降低程度与巨噬细胞促肿瘤的能力相关。

关于miR-223在巨噬细胞激活中的作用，目前较多的研究发现miR-223高表达抑制M1型巨噬细胞的激活［18］。一项在RAW264.7巨噬细胞系中的研究发现，过表达miR-223抑制LPS诱导的IL-6和IL-1β的释放［19］。在肥胖模型中，Zhuang等发现miR-223通过靶向Pknox1抑制巨噬细胞的促炎激活，抑制饮食诱导的脂肪组织炎症反应和系统性胰岛素抵抗［20］。此外，在其他炎性相关疾病模型如风湿［21］和败血症模型中［22］，都发现抑制miR-223的表达促进炎症的发生和临床症状的恶化。至于miR-223在M2型巨噬细胞激活调控中的作用，研究比较少。一项在脂肪组织代谢的研究中发现，miR-223可以通过靶向不同的靶点分别调控M1或M2型的激活，降低miR-223的表达抑制PPARγ依赖的选择性巨噬细胞激活［23］。这项研究的结果与本研究内容相矛盾，分析其原因可能有三方面：①实验模型不同；②实验细胞不同；③诱导因素不同；④miR-223mimics或inhibitor的转染条件不同。由于巨噬细胞属于难转染细胞，本研究采用病毒感染的方式将相应的microRNA转到巨噬细胞中，miR-223的增加或降低比较可靠。而其他研究仅采用脂质体转染的方式，难以确保有效的miR-223的敲低或增加。在一项关于IL-4诱导的巨噬细胞融合的研究中发现，应用IL-4处理巨噬细胞后降低miR-223的表达。在巨噬细胞中过表达miR-223后抑制IL-4促进的巨噬细胞融合，而在miR-223敲除小鼠或miR-223缺失的巨噬细胞中展示出细胞融合的增加。这项研究表明miR-223负向调控IL-4诱导的巨噬细胞生物学功能，与我们的研究趋势一致。

我们实验室前期的研究发现M2型巨噬细胞特异性大量分泌趋化因子CCL18，通过结合到乳腺肿瘤细胞上的PITPNM3受体促进肿瘤细胞的转移［11］。我们的研究发现降低miR-223的表达促进巨噬细胞M2型标记物IL-10，CCL18和CD206的表达。同时，Transwell迁移实验和划痕实验都表明敲低巨噬细胞中miR-223的表达促进共培养肿瘤细胞的迁移，这与趋化因子CCL18的表达趋势一致。由于CCL18能够促进共培养肿瘤细胞的转移，我们推测miR-223降低诱导的巨噬细胞CCL18分泌促进了肿瘤细胞的迁移。

综上所述，本研究发现miR-223在IL-4诱导的M2型巨噬细胞及TAMs中表达下调，敲低miR-223在巨噬细胞中的表达能促进M2型巨噬细胞标记物的表达增加，并促进共培养肿瘤细胞的转移。本研究为靶向肿瘤微环境控制肿瘤转移提供治疗靶点。然而microRNA的调控机制复杂，一个microRNA有不止一个靶基因，因此miR-223调控巨噬细胞M2型激活的机制尚需进一步的研究。此外，本项研究的临床意义也有待进一步收集临床标本进行验证。

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MiR-223 inhibitor promotes the M2 polarization of macrophage

YANG Limei1，YAO Heri2，LIU Yujie2.
1Blood Components Preparation Department，Guangzhou Blood Center，Guangzhou 510095，China.2Breast Tumor Center，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.Corresponding author：LIU Yujie，liuyujie554@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and roles of miR-223 in regulating M2 polarization of macrophage.MethodsThe expression of miR-223 was detected by using qPCR.The phenotype of miR-223 adjusted macrophage was assayed by flow cytometry and Elisa.The ability of MDAMB-231 cellmigration was evaluated by transwelland wound-healing assay.ResultsMiR-223 was highly expressed inmonocytes than in breast cancer cells.The expression of miR-223 was downregulated duringmonocytes differentiation stimulated by Lipopolysaccharides（LPS），IL-4 or cocultured with MDAMB-231 cells.And the extent of miR-223 decrease in IL-4 and coculture group was greater than that in LPS treated group.Knockdown of miR-223 level increasesd the expression of M2 typemacrophagemarkers CCL18，IL-10 and CD206，as well as themotility of cocultured MDA-MB-231 cells.ConclusionMiR-223 could serve as a potential target to improve tumor microenvironment and prevent breast tumormetastasis.

microrna-223；macrophage；breast cancer

R73-37

A

10.3969/j.issn.1009-976X.2017.01.002

2016-12-13）

国家自然科学基金（81102022）；高等学校博士学科点专项科研基金（新教师类）（20110171120082）

1510095广州广州血液中心成分制备部；2510120广州中山大学孙逸仙纪念医院乳腺肿瘤医学部

*通讯作者：刘玉洁，E-mail：liuyujie554@163.com