香砂六君丸对肥胖大鼠胃黏膜JAK2/STAT3通路的影响

陈伟仁　刘文俊　柴纪严　刘旭东　刘慧慧　于化新　王凌志　王路　马丹　王德山　单德红

【摘要】 目的：研究香砂六君丸对肥胖大鼠胃黏膜JAK2和STAT3表达的影响，探讨该方控制肥胖人群罹患胃癌风险的可能性。方法：40只雄性SD大鼠，随机分为对照组、肥胖组（模型组）、香砂六君丸低剂量治疗组（香低组）、香砂六君丸中剂量治疗组（香中组）和香砂六君丸高剂量组治疗组（香高组），每组8只；全自动生化分析仪检测血脂；ELISA法检测血清超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性；免疫组化法检测胃黏膜磷酸化（p）-JAK2/STAT3表达。结果：与对照组比较，模型组的总甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）和MDA水平以及p-JAK2、p-STAT3表达均显著增加，但SOD和高密度脂蛋白（HDL）水平以及GSH-px活性均明显下降。与模型组相比，香低、中和高組的TG和LDL水平显著下降，而SOD水平和GSH-px活性明显上升；香中组和香高组MDA水平和p-JAK2、p-STAT3表达均显著下降；香高组HDL水平明显上升。结论：香砂六君丸能够调控血脂，对抗氧化应激，抑制胃黏膜JAK2/STAT3通路，可能具有降低肥胖人群罹患胃癌的作用。

【关键词】 香砂六君丸； 肥胖； 胃黏膜； JAK2； STAT3

随着现代社会膳食结构的改变和体力活动日渐减少，肥胖的患病率无论在发达国家还是发展中国家均以惊人的速度增长，以美国和中国最为严重。肥胖能够引发众多疾病，特别是可以明显增加消化道肿瘤的罹患风险，但具体机制尚不清楚。近年研究发现，肥胖人群多存在血脂异常和氧化应激，进而通过激活JAK2/STAT3信号通路，引起细胞异常增殖和恶性转化，参与了包括胃肠道肿瘤在内的诸多恶性肿瘤的发生及发展[1-5]。临床报道显示香砂六君丸对消化道溃疡和慢性胃炎等均有一定疗效[6-8]，其机制与调节血脂和对抗氧化应激等有关。由此推测，香砂六君丸可能具有预防肥胖人群罹患胃癌的作用，但相关报道还较少。因此，本实验以肥胖大鼠为实验对象，主要从JAK2/STAT3信号途径方面探讨香砂六君丸的预防作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SPF级SD大鼠，3～4个月龄，体质量（200±10）g，辽宁省本溪巿实验动物中心提供[合格证号：SCXK（辽）-2010-0001]，于辽宁中医药大学实验动物中心饲养[许可证号：SYXK（辽）-2013-000-9]。室温（22±1）℃，相对湿度（50±5）%，自由饮水进食，光∶暗=12 h∶12 h，饲养1周进行适应后，开始实验。

1.2 试剂与药物 香砂六君子丸购于河南省宛西制药股份有限公司（批号140603）；生化质控物（批号0413021）购于四川迈克生物科技股份有限公司；超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒均购于上海尚乐公司（批号DZE30169、DZE30157、DZE35104）；JAK2和STAT3多克隆抗体购于ABclonal（批号A0208、A2211）；Ultra SensitiveTM S-P超敏试剂盒（兔）和DAB，均购于福州迈新生物技术开发有限公司（批号KIT-9706、dab0031）。

1.3 仪器 美国伯乐iMark酶标仪，德国LEICA CM1850切片机，全自动生化分析仪（Accute TBA-40FR），成都泰盟科技公司BI-2000医学图像分析系统。

1.4 方法

1.4.1 分组 大鼠随机分为对照组8只和肥胖组若干，分别给予普通颗粒饲料和高脂饲料（组成：基础饲料55%，猪油15%，蔗糖20%，蛋黄粉9%，胆酸盐1%）[9]，自由饮水。连续喂养180 d后，选择体质量超过对照组（423.97±47.78）g 20%以上[10]的肥胖组大鼠32只（523.99±29.06）g，随机分为肥胖组（模型组）、香砂六君丸低剂量治疗组（香低组）、香砂六君丸中剂量治疗组（香中组）和香砂六君丸高剂量治疗组（香高组），每组8只。

1.4.2 给药方法 香砂六君丸打粉后用蒸馏水冲调，按成人用量折算为大鼠用量，香低、中和高组分别按112.5、225.0和450.0 mg/kg计算出日用量，分早晚2次灌服，连续30 d。对照组和模型组灌服等体积蒸馏水，方法同前。

1.4.3 血清相关指标检测 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（0.35 mL/100 g）后，腹主动脉取血，离心后取血清备用。取部分血清，采用全自动生化分析仪检测血清是总胆固醇（TG）、总甘油三酯（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和高密度脂蛋白（LDL）水平；取部分血清，采用ELISA法，严格按说明书操作，检测超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）活性检测。

1.4.4 胃黏膜JAK2/STAT3表达 采用免疫组化法。取麻醉大鼠胃组织，4 ℃盐水洗净，4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片；脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10 min；微波炉修复抗原5 min；滴加正常山羊血清，室温放置20 min；滴加兔抗大鼠磷酸化（p）-JAK2或p-STAT3抗体50 μL（均浓度1∶100），37 ℃孵育2 h，4 ℃过夜；滴加羊抗兔IgG抗体，室温放置20 min；滴加SABC试剂，室温10 min；DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照采用抗体稀释液代替一抗，步骤同上。阳性结果为胞浆内出现棕黄色颗粒。利用图像分析系统，光镜下选取相同部位相同视野，分析免疫阳性染色的平均光密度。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂变化 与对照组比较，模型组的TG、TC和LDL水平均显著上升（P<0.01，P<0.05，P<0.01），但HDL水平明显下降（P<0.01）；与模型组相比，香低组、香中组和香高组的TG和LDL水平均显著下降（P<0.01），但香高组HDL水平明显上升（P<0.01）。见表1。

2.2 各组大鼠氧化应激成分和JAK2/STAT3表达变化 与对照组比较，模型组SOD和GSH-px均显著降低（P<0.05，P<0.01），但模型组MDA、p-JAK2和p-STAT3表达均显著增加（P<0.01）；与模型组比较，香低、中和高组SOD和GSH-px均明显上升（P<0.05；P<0.05，P<0.01，P<0.01），香中和高组MDA水平和p-JAK2、p-STAT3表達均显著下降（均P<0.01）。见表2。

3 讨论

随着肥胖症发病率的日渐提高，社会和家庭的负担也随之增加，因此国内外开展了大量的研究工作，探索减肥和预防并发症的方法。研究显示，众多减肥措施的初期效果明显，但长期效果较差，常常出现反弹，这就需要研制一套长效减肥机制，但目前进展不大[11-12]。因此医患不得不共同正视现实，在减肥的同时控制并发症，极力维护患者的健康，提高生活质量。

血脂异常是肥胖人群常见症状，并可由此产生氧化应激，导致自由基产生过多，进而参与炎症、过敏和肿瘤等众多疾病的发生发展，因此调控血脂是防治肥胖人群罹患他病的重要手段。近年来降脂药物的研发较多，也取得了一些成果，但兼具高效低毒的药物还不多。中药复方能够多环节、多靶点起效，具有毒副作用小的特点，是调控血脂的重要选择。香砂六君方出自《太平惠民和剂局方》，由木香、砂仁、党参、白术、茯苓、炙甘草、陈皮、半夏、生姜和大枣等组成。该方以四君子汤为基础加减化裁而成，其中人参、白术、茯苓、炙甘草益气健脾，陈皮、半夏能够和胃化湿，降逆止呕，而木香、砂仁则可以疏通脾胃气滞，消胀散满，故全方可以健脾和胃，主治脾虚气滞、消化不良、脘腹胀满等症。该方原为汤剂，1963年版《中国药典》（一部）将党参代替人参，制成水丸，称为香砂六君子丸，后1977年版《中国药典》将其改名为香砂六君丸，现又将水丸改进为浓缩丸剂，收录于《卫生部药品标准》（中成药分册）第七册。

研究显示，香砂六君丸能够在一定程度上调节血脂和对抗氧化应激[13]。本研究也观察到类似结果，如香低组、香中组和香高组的TG、LDL水平均显著低于模型组，而香高组HDL水平明显高于模型组（P<0.05）；香低组、香中组和香高组SOD和GSH-px均明显高于模型组，而香中和高组MDA水平明显低于对照组（P<0.05）。此外，在量效关系上来看，高剂量香砂六君丸的效果要更好。但研究发现，尽管采取了许多措施来控制血脂、对抗氧化应激，肥胖人群的肿瘤发病率还是要高于体质量正常的人群，原因可能还不清楚，推测与脂肪细胞能够释放众多细胞因子有关。脂肪细胞也可以称为内分泌细胞，能够合成释放干扰素、白细胞介素、表皮细胞生长因子等众多成分，从而影响相关细胞的结构和功能[14-17]。虽然每个细胞因子的作用途径有所不同，但多数都涉及了JAK2/STAT3信号通路。JAK2/STAT3通路能够介导众多细胞因子诱发的细胞异常增殖和分化，参与炎症和肿瘤等一系列疾病的发生，目前是胃癌早期筛查的重要生物学标志物之一[18-21]。

本实验观察到，模型组大鼠胃黏膜p-JAK2和p-STAT3表达均明显高于对照组（P<0.05），说明肥胖可激活胃黏膜细胞内JAK2/STAT3通路，提示该组大鼠胃黏膜细胞可能出现异常分化，是胃癌发生的一个先兆，因此及时干预此通路可能具有预防胃黏膜细胞分化的作用。香砂六君丸能够健脾化痰和胃，能否用于胃癌防治还不清楚。本研究结果显示，香中组和香高组的p-JAK2和p-STAT3表达均显著低于模型组（P<0.05），表明中、高剂量的香砂六君丸能够抑制肥胖大鼠胃黏膜细胞JAK2/STAT3通路，提示该药可能具有对抗肥胖大鼠胃黏膜细胞异常分化的作用，但详细作用还需要深入研究。

综上所述，肥胖可引起血脂异常、氧化应激和胃黏膜细胞JAK2/STAT3异常激活，而香砂六君丸能够调控血脂，对抗氧化应激，并抑制胃黏膜细胞JAK2/STAT3信号途径的异常激活，可能具有预防胃黏膜细胞异常增殖和分化的作用。因此，可以考虑先期服用香砂六君丸，降低肥胖人群罹患胃癌的风险。

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（收稿日期：2017-01-20） （本文編辑：程旭然）