奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室重构和Cx43表达的影响

殷 莎，魏泽卉，张 飞，牛梦珍，王 燕

(山西医科大学药理学教研室，太原 030001；*通讯作者，E-mail：butou1977@163.com)

奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室重构和Cx43表达的影响

殷 莎，魏泽卉，张 飞，牛梦珍，王 燕*

(山西医科大学药理学教研室，太原 030001；*通讯作者，E-mail：butou1977@163.com)

目的 观察奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室重构及心肌连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达的影响。 方法 将24只Wistar大鼠随机分为4组：空白对照组、模型组、奈必洛尔组和阿替洛尔组。除空白对照组，其余三组给予L-NAME(60 mg/kg)制备高血压模型鼠，药物治疗组同时分别给予奈必洛尔(8 mg/kg)和阿替洛尔(80 mg/kg)。给药8周，期间每周测定一次收缩压。实验结束后，3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠，快速分离心脏，免疫组化和Western blot观察左心室Cx43分布和蛋白表达。 结果 与空白对照组比较，模型组大鼠在给予L-NAME 1周后血压逐渐升高，到给药第8周时高达(192.36±6.95)mmHg。奈必洛尔组血压较模型组显著降低，且明显较阿替洛尔组低。模型组左心室重构，Cx43蛋白表达降低。奈必洛尔抑制左心室重构，增加Cx43表达，改善L-NAME致高血压大鼠Cx43排列紊乱，但阿替洛尔仅增加Cx43表达(P<0.05)，对左心室重构无显著影响。 结论 奈必洛尔在显著降压的同时，可改善L-NAME高血压大鼠左心室重构，增加心肌Cx43表达。

奈必洛尔； 缝隙连接蛋白43； L-硝基精氨酸甲酯； 高血压

奈必洛尔作为选择性阻断β1肾上腺素受体的新型抗高血压药物，有着确切的降压作用和内皮保护功能[4]。本课题组前期实验证实，奈必洛尔在降压同时，改善自发性高血压大鼠(SHR)心室重构和Cx43表达异常[5]。但是需要注意的是，不同的高血压动物模型，其升高血压及心肌病理改变不同。奈必洛尔是否对其他高血压动物模型左心室重构和Cx43表达改变也具有改善作用呢?

L-NAME是一氧化氮合酶(NOS)抑制剂。L-NAME致大鼠高血压是基础研究中常用的高血压模型。长期慢性L-NAME可导致体内一氧化氮(NO)缺乏，导致内皮功能障碍，心肌肥大，心室重构及Cx43表达异常。本研究以L-NAME致高血压大鼠为实验对象，观察奈必洛尔对L-NAME致高血压模型大鼠左心室重构和Cx43表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级12周龄Wistar大鼠，雄性，由中国科学研究院上海实验动物中心提供，恒温恒湿饲养。

1.2 药品与仪器

L-NAME购自Sigma公司，阿替洛尔购自西亚试剂公司，奈比洛尔由德国Menarini公司免费提供，Cx43抗体和HE染色试剂盒购自武汉博士德有限公司。无创血压计购自成都泰盟科技有限公司。其余试剂均为市售分析纯。

1.3 实验模型和分组

第二，不是所有的学生都能成为大师并进入艺术史。而且能否进入艺术史之类的问题，也绝非靠绘画而诗意栖居的很多学生辈画家的远大理想。面对修炼成佛这样的主题，他们或许只想成为修行意义上的香客而非佛本身。如同我们不能要求所有的香客都成佛一样，我们也不能奢望所有的学生都进入艺术史。当绝大多数学生都因为主客观原因而不能进入艺术史时，我们应该给予他们充分的尊敬，同时主动调低自己的学术评论指数，瞩目并祝福他们以艺术的名义而享有的和谐生活。

12周龄Wistar大鼠随机分为4组：空白对照组、模型组[L-NAME 60 mg/(kg·d)]、奈比洛尔组[L-NAME 60 mg/(kg·d)+奈必洛尔8 mg/(kg·d)]、阿替洛尔组[L-NAME 60 mg/(kg·d)+阿替洛尔80 mg/(kg·d)]。连续灌胃给药8周，期间所有大鼠每周测定一次收缩压。试验结束，3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠，快速分离心脏，取左心室做免疫组织化学和Western blot实验。

1.4 大鼠尾动脉压测量

使用大鼠无创血压测量仪，调零预热之后采用尾袖套法对清醒的大鼠尾动脉进行收缩压测量。大鼠尾部插入加压套，使尾根部紧贴于脉搏传感器上方，待尾动脉充分充盈，脉搏波稳定之后测量3次血压，取平均值。每周测量一次，选取同一时间段进行测量。

1.5 HE染色和免疫组织化学染色方法

试验结束后，3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，剪开胸腔，快速分离心脏，冰生理盐水漂洗。垂直于心脏长轴对称中点上下切取厚度为2-3 mm横截面，放入4%多聚甲醛中固定，12-24 h后石蜡包埋，用于HE染色和免疫组化实验。其余心肌组织放入液氮中，最后保存于-80 ℃冰箱，用于Western blot实验。

心脏常规石蜡包埋后，连续切片，片厚4 μm，多聚赖氨酸贴片。切片按常规方法脱蜡至水，HE染色观察左心室重构。在免疫组化实验中，切片脱蜡至水后，0.3%过氧化氢孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，热修复抗原，10%山羊血清封闭1 h，加入兔抗大鼠Cx43(1 ∶100)单克隆抗体，4 ℃冰箱过夜，加入羊抗兔二抗，室温1 h，DAB显色，苏木素复染。结果判断：深棕色黄色颗粒为Cx43表达阳性，细胞核为淡蓝色。

1.6 Western blot 方法检测大鼠心肌组织Cx43蛋白表达水平

取心肌组织标本50 mg，置于研钵中在液氮中研磨，按100 mg/ml的比例加入裂解缓冲液，充分研磨后,于4 ℃低温离心机以13 000×g离心20 min，取上清液测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后转膜，用TBST液洗涤印迹膜。放入5%脱脂奶粉封闭液内，摇床震动室温封闭2 h。将封闭后的膜放入杂交盒中，加入兔抗大鼠Cx43，p-CX43 S368一抗，摇床4 ℃过夜。将孵育后的膜放入二抗中，室温摇床孵育。以GAPDH为内参照蛋白。用增强化学发光法显色，凝胶成像分析系统摄像分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠收缩压影响

与空白对照组相比，模型组血压持续性升高，到第8周高达(192.36±6.95)mmHg。奈必洛尔及阿替洛尔均可有效降低血压，且奈必洛尔组较阿替洛尔组降压作用更为明显(P<0.05，见表1)。

2.2 奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室重构的影响

空白对照组大鼠的心肌细胞形态正常，肌纤维排列致密、整齐，无显著的病理改变。L模型组可见心肌纤维排列杂乱不规律。奈必洛尔可改善心肌排列紊乱，但阿替洛尔组无明显改善(见图1)。模型组心肌横断面积(CSA)明显大于空白对照组和奈必洛尔组(P<0.05，见图2)。奈必洛尔可显著降低心肌横断面积，但阿替洛尔则无明显影响。

表1 奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠收缩压影响 (mmHg)

Table 1 The effect of nebivolol on the systolic blood pressure in the hypertension rats induced by L-NAME (mmHg)

给药周数空白对照组模型组奈必洛尔组阿替洛尔组0117．67±9．05126．32±7．23129．13±8．12132．62±6．291120．32±8．69∗139．15±8．01136．29±9．12137．31±8．112123．20±10．12148．20±6．18140．36±11．02140．96±9．543124．15±7．37169．41±7．16145．69±10．63∗156．31±9．18∗4119．85±9．32∗171．26±7．33150．96±7．09∗#164．32±10．295123．42±8．39∗179．16±6．62 155．02±9．15∗#169．12±9．166117．5±10．43∗186．79±9．12 153．10±8．93∗# 170．25±8．97∗7126．8±11．62∗198．63±7．18155．31±11．02∗#180．17±10．69∗8128．4±11．45∗192．36±6．95152．94±10．59∗#176．22±10．29∗ 与模型组比较，∗P<0．05；与阿替洛尔组比较，#P<0．05

A.空白对照组 B.模型组

C.奈必洛尔组 D.阿替洛尔组图1 奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室重构的影响 (HE,×200)Figure 1 The effect of nebivolol on left ventricular remodeling in hypertension rats indeced by L-NAME (HE staining,×200)

与空白对照组比较，△P<0.05;与模型组比较，*P<0.05；与阿替洛尔组比较，#P<0.05图2 奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室心肌横断面积(CSA)的影响Figure 2 Effect of nebivolol on myocardial cross-sectionalarea(CSA)in hypertension rats induced by L-NAME

2.3 奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室Cx43分布和表达的影响

Cx43的阳性表达呈黄色或棕色颗粒。空白对照组Cx43排列规整，主要分布于心肌细胞闰盘处(见图3)。模型组Cx43排列紊乱，并且蛋白表达显著减少(P<0.05)。奈必洛尔可改善L-NAME致高血压大鼠Cx43排列紊乱，增加其表达，且较阿替洛尔显著(P<0.05，见图4)。

3 讨论

本实验结果表示，连续灌胃8周，L-NAME可导致大鼠血压进行性升高，同时伴随左心室重构和Cx43表达变化。奈必洛尔在显著降压的同时，可改善L-NAME致高血压大鼠心肌上述改变。

A.空白对照组 B.模型组 C.奈必洛尔组 D.阿替洛尔组图3 奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室Cx43分布和表达的影响 (免疫组化,×200)Figure 3 The effect of nebivolol on distribution and expression of Cx43 in left ventricle of hypertension rats induced by L-NAME (immunohistochemistry,×200)

与空白对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与阿替洛尔组比较，#P<0.05图4 奈必洛尔对L-NAME致高血压大鼠左心室Cx43表达的影响Figure 4 The effect of nebivolol on expression of Cx43 in left ventricle of hypertension rats induced by L-NAME

血管内皮来源的NO对维持机体血压平衡具有重要作用。NO缺乏可导致一系列心血管疾病的发生，如高血压、动脉粥样硬化等。长期给予竞争性NOS抑制剂L-NAME可引发动物的持续性血压升高，这主要与血管产生的NO减少有关[6]。在本研究中利用L-NAME诱发大鼠持续性的血压升高，表明该模型建立是可靠的，是一种理想的高血压动物模型。奈必洛尔和阿替洛尔均可以显著降低模型组大鼠血压，但奈必洛尔的降压作用更为显著。这与我们在SHR实验中观察到的结果一致。前期实验显示奈必洛尔除了抑制β1受体之外，还可以舒张大鼠不同动脉，并且这种舒张血管作用是NO依赖性的[7]。L-NAME还可通过激动肾素血管紧张素系统(RAS)升高血压[8]。本课题组前期研究表明，奈必洛尔可抑制SHR循环和局部RAS系统，而阿替洛尔则对RAS系统无显著影响[9]。结合本实验，因此本课题组推测奈比洛尔促进NO释放,舒张血管,抑制RAS系统可能是奈必洛尔降压作用较阿替洛尔显著的原因。

L-NAME抑制NOS活性，减少NO生成，不仅升高血压，而且促进左心室重构。Bunbupha等[10]研究发现L-NAME 40 mg/kg连续给药8周可造成左心室重构。这与本实验研究结果一致。NO减少血管紧张素Ⅱ分泌，而作为NOS抑制剂，L-NAME可增加AngⅡ生成。这说明在L-NAME致高血压模型大鼠，心脏局部组织RAS参与左心室重构[11]。本课题组前期实验发现奈必洛尔可改善SHR左心室重构，这种改善与降低心室AngⅡ有关[12]。因此有理由推测，奈必洛尔改善L-NAME致高血压大鼠左心室重构与其降低心脏AngⅡ有关。

已知生理状态下Cx43有两种状态：磷酸化与非磷酸化。这两种状态的Cx43共同存在于细胞膜上，而磷酸化Cx43则是完成信息交流的主要状态。在基础状态下，心室肌绝大部分Cx43处于磷酸化状态。在高血压状态下，Cx43降解和脱磷酸化大量增加。Cx43的羧基末端241-382为主要的磷酸化区，也是多种激素的识别位点，大多数蛋白质相互作用发生于此，羧基末端丝/苏氨酸残基的磷酸化程度决定着缝隙连接的通透性。本实验中，Western blot结果显示L-NAME致高血压大鼠心肌p-Cx43 S368表达降低，而这一改变可以被奈必洛尔纠正。因此本研究小组认为，奈必洛尔对Cx43的调节作用有可能是通过调节其磷酸化水平而实现的。

综上所述，奈必洛尔在有效降低L-NAME致高血压模型大鼠血压的同时，能够上调左心室Cx43及其磷酸化的表达，减轻左心室Cx43的重构，对靶器官的损害有明显改善作用，为奈必洛尔在高血压的临床应用，提供了积极的基础理论支持。

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mechanism.MethodsAPN and APN receptors(AdipoR1 and AdipoR2)in cultured adipocytes and vascular smooth muscle cells(VSMCs)were detected by Western blot,and the expression of APN in adipocytes and the expression of AdipoR in VSMCs were also detected after angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ)treatment.The expression of APN and AdipoR in the blood vessels of control and Ang Ⅱ-treated C57BL/6 mice were detected by immunofluorescence staining.Transwell assay was used to observe the migration of VSMCs.ResultsAPN mainly expressed in the perivascular adipocytes,while AdipoR1 and AdipoR2 ubiquitously expressed in the blood vessels.Angiotensin II(Ang Ⅱ)-induced vascular injury resulted in a significant decrease of APN(11.7%±3.6%vs3.0%±1.5%),AdipoR1(13.2%±4.0%vs2.7%±1.6%)and AdipoR2(22.4%±7.1%vs5.7%±1.2%)in the perivascular adipocytes and vascular cells.Immunofluorescence results showed that the distribution and expression of APN and its receptors in blood vessels of mice exhibited the similar tendency as theinvitroresults.APN attenuated Ang Ⅱ-induced vascular smooth muscle cells(VSMCs)migration and p38 phosphorylation(1.2±0.08vs2.3±0.46,P<0.05).ConclusionThe results suggest that perivascular adipocytes-derived APN may attenuate hypertensive vascular injury via its receptor-mediated inhibition of p38 signaling pathway.

Effect of nebivolol on left ventricular and Cx43 remodeling in L-NAME-induced hypertensive rats

YIN Sha,WEI Zehui,ZHANG Fei,NIU Mengzhen,WANG Yan*

(DepartmentofPharmacology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001，China;*Correspondingauthor,E-mail:butou1977@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of nebivololon on left ventricular remodeling and Cx43 expression in L-NAME-induced hypertensive rats.MethodsAll Wistar rats were randomly divided into 4 groups：blank control group,model group,nebivolol group and atenolol group.The model rats were induced by L-NAME.The rats were respectively administered with nebivolol and atenolol for 8 weeks in nebivolol group and atenolol group.The systolic blood pressure was measured every week during the treatment.At the end of experiment,the structure of left ventricle was observed using HE staining.Immunohistochemistry and Western blot were used to observe the expression of Cx43 in the left ventricle of rats.ResultsCompared with control group,the blood pressure was significantly increased at 1 week in model group(P<0.05),and reached (192.36±6.95)mmHg at 8 week.The blood pressure in nebivolol group was significantly lower than in model group and atenolol group(P<0.05).In nebivolol group,the L-NAME-induced arrangement of Cx43 and left ventricular remodeling were alleviated and the decreased expression of Cx43 was increased.While atenolol just had an influence on Cx43 expression but not left ventricular remodeling.ConclusionNebivolol may reduce the blood pressure and increase the expression of Cx43 in L-NAME-induced hypertensive rats,therefore inhibit the remodeling of left ventricular.

nebivolol； Cx43； L-NAME； hypertension

山西省青年科技研究基金资助项目(2012021033-3)

殷莎，女，1990-12生，在读硕士，E-mail：690506596@qq.com

2016-11-25

R544.1

A

1007-6611(2017)03-0201-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.001