基因4型戊型肝炎病毒ORF3蛋白氨基酸变异的初步探讨

朱永豹

基因4型戊型肝炎病毒ORF3蛋白氨基酸变异的初步探讨

朱永豹

目的 初步探讨戊型肝炎病毒（HEV）ORF3蛋白氨基酸变异情况，为其功能研究提供相关线索。方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增41株基因4型HEV RNA ORF3基因片段，将PCR产物与pMD18-T Vector连接，转化到大肠埃希菌JM109筛选阳性克隆测序，然后采用DNAstar软件将测序结果翻译成氨基酸序列，初步探讨其变异情况及与基因1型HEV ORF3蛋白差异。结果 19株HEV RNA ORF3扩增阳性，其长度均为345bp，编码蛋白含有114个氨基酸，共19个位点突变，突变分布于D2区、P1区和P2区，D1区无突变；与基因1型HEV ORF3蛋白比较，基因4型HEV ORF3蛋白的D1区、D2区、P1区和P2区均存在一个或多个氨基酸突变，P2区两个PXXP基序无突变。结论 与基因1型HEV ORF3蛋白比较，基因4型HEV ORF3蛋白的D1区、D2区、P1区和P2区氨基酸均存在突变，这些变异是否影响我国基因4型HEV ORF3蛋白结构和功能仍需进一步研究；但P2区两个PXXP基序高度保守，推测其可能在不同型HEV致病过程中起着重要的作用。

戊型肝炎病毒 ORF3蛋白 氨基酸变异

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）主要流行于卫生条件低下的亚非国家，发达国家也有散发，严重危害人类健康，是一个重要的全球问题，其病原体戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是一种无包膜、单股正链RNA病毒，基因组全长约7.2kb，包括三个开放读码框（open reading frames，ORFs），其中ORF1蛋白和ORF2蛋白的功能研究比较透彻，而ORF3蛋白功能尚不清楚，近年来研究显示HEV可能与促进细胞存活、抑制机体免疫反应和病毒感染及颗粒装配、释放等有关，这些功能一般是通过ORF3蛋白含有的某些特异氨基酸区域实现的［1-7］，一旦上述区域的氨基酸发生突变，ORF3蛋白的结构和功能是否改变不得而知，本研究主要探讨基因4型HEV ORF3蛋白氨基酸变异情况，为其功能研究提供一些线索，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集41株基因4型HEV毒株血清标本。

1.2 方法 （1）引物合成：参照文献［8］报道的引物，上游引物为：5'-CATGGCGATGCCACCATGCGC-3'，下游引物为：5 '- TCAGCGGCGAAGCCCCAGCT-3'，目的片段长度为346 bp，由上海英俊生物技术有限公司合成。（2）病毒RNA提取：取200μl血清，采用Trizol试剂（美国GIBCO公司）按其说明书提取血清病毒RNA，最后将RNA溶于20μl DEPC水中。（3）RT-nPCR扩增：20μl逆转录体系，以oligo（dT）18为逆转录引物，M-MLV逆转录酶（日本TOYOBO公司）42℃逆转录45min。采用PCR扩增HEV cDNA基因片段，PCR反应体系含有逆转录产物10μl、dNTP各200μmol/L、引物0.6μmol/L、LA Taq酶1.25U和2×GC buffer 12.5μl，总体积为25μl。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。（4）DNA纯化、测序及翻译：PCR产物DNA片段纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T Vector连接，转化到大肠埃希菌JM109（大连宝生物工程有限公司），蓝白筛选阳性克隆，送上海英俊生物技术有限公司测序；采用DNAstar软件将测序结果翻译成氨基酸序列。

2 结果

19株HEV RNA ORF3基因片段扩增阳性，其长度均为345bp，编码蛋白含有114个氨基酸，共19个位点突变，突变分布于D2区、P1区和P2区，D1区无氨基酸突变；与基因1型HEV ORF3蛋白比较，基因4型HEV ORF3蛋白的D1区、D2区、P1区和P2区均存在一个或多个氨基酸突变，P2区两个PXXP基序无氨基酸突变。见图1。

图1 HEV ORF3蛋白氨基酸变异

3 讨论

过去一直认为戊型肝炎病毒（HEV）ORF3的基因长度为372bp，编码123个氨基酸，但后来有学者研究发现ORF3的第三个AUG才是起始密码子，致使其编码蛋白缩短，含有112～114个氨基酸［9］。

迄今为止，HEV ORF3蛋白的功能研究主要针对基因1型，研究结果显示基因1型HEV ORF3蛋白的N端含有两个疏水区（D1区和D2区），C端含有两个多脯氨基酸区（P1区和P2区），其中D1区富含半胱氨酸，与细胞骨架形成有关［6］，与Pystl结合［3］，D2区与血红素结合蛋白结合，P1区存在一个Ser71磷酸化位点［6］，P2区两个重叠PXXP基序与许多含有SH3结构域的信号传导分子结合［1］，可见ORF3蛋白的功能主要是通过某些特异氨基酸区域实现的，故作者探讨基因4型HEV ORF3蛋白氨基酸变异情况及与基因1型HEV ORF3蛋白比较其氨基酸差异，结果基因4型HEV ORF3蛋白共19个氨基酸位点突变，突变分布于D2区、P1区和P2区，D1区无氨基酸突变；与基因1型HEV ORF3蛋白比较，基因4型HEV ORF3蛋白的D1区、D2区、P1区和P2区均存在一个或多个氨基酸突变，但P2区两个PXXP基序无氨基酸突变；其中D1区相对保守，仅13位点的半胱氨酸突变为苯丙氨酸，D2区主要是丙氨酸和缬氨酸的相互替换，P1区变异较大，变异率高达58.33%，以往熟知的71位点不是丝氨酸，而是替换为苯丙氨酸或酪氨酸，Graff J等曾研究表明ORF3蛋白磷酸化在病毒基因组复制和感染性病毒颗粒产生过程中并不是必需的［5］，P2区两个PXXP基序高度保守，除具有与含有SH3结构域的信号传导分子结合的能力外，PSAP基序也与肿瘤易感基因101结合，从而促进α1微球蛋白的分泌，抑制机体免疫反应［4］，完整的PASP基序是病毒颗粒从感染细胞内释放必不可少的［7］，据此推测PXXP基序在HEV致病过程中可能起着重要的作用，但上述变异是否影响基因4型HEV ORF3蛋白的结构和功能，以致区别于基因1型HEV ORF3蛋白，仍需进一步研究。

目前关于基因4型HEV ORF3蛋白的研究较少，而我国临床上的HE主要由基因4型HEV感染所致，基因1型所致的相对较少，所以更应加大基因4型HEV ORF3蛋白的功能研究。

［1］ Korkaya H,Jameel S,Gupta D,et al.The ORF3 protein of hepatitis E virus binds to Src homology 3 domains and activates MAPK.J Biol Chem,2001,276(45):42389-42400.

［2］ Chandm V,Kalia M,Hajela K,et al.The 0RF3 protein of hepatitis E virus delays degradation activated growth factor receptors by interacting with CIN85 and blocking fomation of the Cbl-CIN85 complex.J Virol,2010,84(8):3857-3867

［3］ Kar-Roy A,Korkaya H,Oberoi R,et al.The hepatitis E virus open reading frame 3 protein activates ERK through binding and inhibition of the MAPK phosphatase.J Biol Chem,2004,279(27):28345-28357.

［4］ Surjit M,Oberoi R,Kumar R,et al.Enhanced alpha1 microglobulin secretion from Hepatitis E virus ORF3-expressing human hepatoma cells is mediated by the tumor susceptibility gene 101.J Biol Chem,2006,281(12):8135-8142

［5］ Graff J,Nguyen H,Yu C,et al.The open reading frame 3 gene of hepatitis E virus contains a cis-reactive element and encodes a protein required for infection of macaques.J Virol,2005,79(11):6680-6689.

［6］ Zafrullah M,Ozdener MH,Panda SK,et al.The ORF3 protein of hepatitis E virus is a phosphoprotein that associates with the cytoskeleton.J Virol,1997,71(12):9045-9053.

［7］ Nagashima S,Takahashi M,Jirintai,et al.A PSAP motif in the ORF3 protein of hepatitis E virus is necessary for virion release from infected cells?.J Gen Virol,2011,92(Pt2):269-278

［8］ 章述军,田德英,刘曦.基因 IV型 HEV ORF3 真核表达质粒的构建与鉴定.中国现代医学杂志,2010,20(1) :57-59.

［9］ Graff J,Torian U,Nguyen H,et al.A bicistronic subgenomic mRNA encodes both the ORF2 and ORF3 proteins of hepatitis E virus.J Virol,2006,80(12):5919-5926

Objective To preliminarily discuss amino acids mutation in the the ORF3 protein of genotype 4 hepatitis E virus（HEV）ORF3 protein. Methods The ORF3 gene fragment of 41 genotype 4 HEV RNA were amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction（RTPCR）. The PCR products were connected with pMD18-T Vector.After the recombinant plasmids were transformed into E.coli JM109，the positive clones were obtained and sequenced.Then the sequencing results were translated into amino acid with DNAstar software. The amino acid mutations of genotype 4 HEV ORF3 protein were preliminarily discussed. The amino acids differences between genotype 4 and genotype 1 HEV ORF3 protein were also preliminarily discussed. Results The positive ORF3s were amplified in 19 out of 41 genotype 4 HEV. Its length is 345bp，encoding a protein containing 114 amino acids. There were 19 amino acid sites mutation locating in the D2 region，P1 region and P2 region. The D1 region had no amino acids mutation. Compared with that of genotype 1 HEV ORF3 protein，there were one or multiple amino acid mutations in the D1 region，D2 region，P1 region and P2 region of genotype 4 HEV ORF3 protein. The two PXXP motifs of P2 region had no amino acids mutation. Conclusions Compared with that of genotype 1 HEV ORF3 protein，there are some differences in the D1 region，D2 region，P1 region and P2 region of genotype 4 HEV ORF3 protein. Whether these mutations affect the ORF3 protein structure and function of genotype 4 HEV in China needs to be further studied. But the two PXXP motifs of P2 region are highly conserved，suggesting that they may play an important role in the pathogenesis of different genotypes HEV.

hepatitis E virus ORF3 protein Amino acid mutation

236000 安徽医科大学附属阜阳医院感染科