丹参酮I 对高雄诱导的PCOS模型大鼠性激素及卵巢功能的影响

陈夏凉 曲凡 金悦⋆

丹参酮I 对高雄诱导的PCOS模型大鼠性激素及卵巢功能的影响

陈夏凉 曲凡 金悦⋆

目的 探讨丹参酮I（Tan-I）对高雄诱导的多囊卵巢综合征（PCOS）模型大鼠性激素及卵巢功能的影响。方法 通过皮下注射丙酸睾酮建立PCOS大鼠模型。新生雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组，PCOS+Tan-I高、中、低剂量组和PCOS模型组。结果 Tan-I显著降低大鼠血清LH、LH/FSH和FAI的水平，显著升高大鼠血清FSH的表达水平，同时Tan-I显著升高大鼠卵巢组织中PPARG1水平，降低NCOR1和HDAC3 mRNA的表达水平。Tan-I对上述因子的改善作用呈剂量相关性。结论 Tan-I通过改善大鼠血清性激素水平以及卵巢功能的表达水平而达到治疗PCOS的目的。

丹参酮I 高雄 多囊卵巢综合征

多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄妇女中最常见的妇科内分泌疾病。全球范围内5%～10%育龄妇女受此病困扰，该疾病以无排卵性月经、不孕、高雄激素血症和胰岛素抵抗为特征［1］。丹参是双子叶植物唇形科 Labiatae 丹参 Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根，其有效成分有脂溶性和水溶性两大类。近年来，随着对丹参中各类成分研究的不断深入，其应用范围不断扩大并取得了显著的疗效［2-3］。丹参酮I（Tanshinone I，Tan-I）是丹参主要脂溶性成分之一。本文就Tan-I对高雄诱导的PCOS模型大鼠性激素及卵巢功能的影响进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料 选择新生雌性Sprague-Dawley大鼠15g左右，共50只，由母鼠喂养21d。断奶后饲养环境为24h明暗循环，自由饮食，温度25℃，湿度55%。随机分为正常对照组，PCOS+Tan-I高、中、低剂量组和PCOS模型组，每组各10只大鼠。PCOS造模大鼠于9日龄时以0.004ml/g颈部皮下注射溶于橄榄油中的丙酸睾酮（每25mg丙酸睾酮溶于1ml橄榄油中）［4］。正常对照组大鼠给予相应剂量的橄榄油。PCOS+Tan-I高、中、低剂量组是在PCOS造模的基础上，分别给予不同剂量的Tan-I灌胃处理：200mg/（kg·d）（高剂量组），100mg/（kg·d）（中剂量组），50mg/（kg·d）（低剂量组）。每日阴道涂片观察动情周期。PCOS成模标准：从70日龄起，每日行阴道脱落细胞涂片后HE染色观察，持续10d，若呈现持续角化上皮，提示排卵障碍；卵巢切片可呈现多囊样改变；血清中雄激素水平升高。

1.2 方法 10周后，处死大鼠，采集外周血及卵巢组织。大鼠卵巢组织干冰预冷后-80℃保存。应用化学发光法检测血清中黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、总睾酮（total testosterone，TT）的水平，使用仪器为DPCi2000以及相关配套试剂。应用放射免疫分析法检测血清中雌二醇（estradiol，E2）的水平，检测使用仪器为上海核所日环光电仪器有限公司生产的SN-6105，使用试剂为天津九鼎医学生物有限公司出品。采用酶免法（ELISA）检测血清中性激素结合蛋白（sex hormonebinding globulin，SHBG）的水平，使用酶标仪型号为DENLEY DRAGON Wellscan MK，分析软件为Ascent software for Multiskan。检测方法参照说明书进行。应用Real-time PCR检测各组大鼠卵巢组织中关键基因PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表达改变，大鼠PPARG1，HDAC3，NCOR1和GAPDH 基因引物由上海生工公司提供。Tan-I购于西安鸿生生物技术有限公司。丙酸睾酮购于美国SIGMA公司。游离雄激素指数（FAI）FAI=TT（nmol/L）/SHBG（nmol/L）×100。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以%表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tan-I 对各组大鼠血清性激素水平的影响 除各组大鼠血清E2水平和PCOS+Tan-I高剂量组大鼠血清FSH水平外，其余各组大鼠血清LH，LH/FSH和FAI水平均显著高于正常对照组（P＜0.05）；FSH水平均显著低于正常对照组（P＜0.05）。除各组大鼠血清E2水平和PCOS+Tan-I低剂量组大鼠血清LH水平外，其余各组大鼠血清LH，LH/FSH和FAI水平均显著低于模型对照组（P＜0.05）；FSH水平均显著高于模型对照组（P＜0.05）。除血清E2水平外，Tan-I对PCOS模型大鼠血清LH，FSH，LH/FSH和FAI的改善作用呈剂量相关性。见表1。

表1 各组大鼠血清性激素水平（x±s）

2.2 Tan-I对各组大鼠卵巢组织中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表达的影响 正常对照组大鼠卵巢组织中PPARG1mRNA表达水平显著高于其余各组（P＜0.05）。模型对照组大鼠卵巢组织中PPARG1mRNA表达水平显著低于其余各组（P＜0.05）。正常对照组大鼠卵巢组织 中NCOR1和HDAC3 mRNA表达水平显著低于其余各组（P＜0.05）。模型对照组大鼠卵巢组织 中NCOR1和 HDAC3 mRNA表达水平显著高于其余各 组（P＜0.05）。Tan-I对 PCOS模型大鼠卵巢组织 中PPARG1、NCOR1和 HDAC3 mRNA表达水平的改善作用呈剂量相关性。见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表达水平

3 讨论

丹参始载于《神农本草经》，在历代本草中均有收载，被列为上品。古代常用于治疗月经不调、经闭痛经、症瘕积聚、肝脾肿大、心绞痛等病症［2-3］。丹参来源充足，价格低廉，使用方便，临床进一步深入研究并推广应用。

PPARG 是核受体转录因子超家族的一员，其参与了体内糖脂代谢、细胞增殖凋亡等过程，影响PCOS、肥胖等代谢性疾病的发生。PPARG的不同亚型在生殖和代谢系统中分别发挥着举足轻重的作用。其中，PPARG1是在卵巢中占主导地位的一个亚型，在卵巢正常功能的维持上起着多方面的关键作用，具体涉及了颗粒细胞的增殖与分化，糖-胰岛素稳态的维持，甾体激素的生成，卵巢的组织重塑等［5］。Pioglitazone和rosiglitazone 等PPARG的激动剂能够缓解临床PCOS患者的高雄症和排卵障碍［6］，提示PPARG在卵巢卵泡发育中的重要作用，而PCOS 患者存在PPARG 的功能受损。作为核转录因子，PPARG 的转录活性需要多种共调节子的共同参与协同完成，NCOR1 和HDAC3是其中两个最重要的共抑制子［7］。NCOR1 是一个具有复杂功能域的大蛋白，其接受核受体的招募而介导转录抑制路通，可与HDAC3稳定结合后成为HDAC3 的激活亚单位，其对个体的生殖发育过程至关重要［8］。本研究选择TT、SHBG、FAI、LH和FSH 反映Tan-I对高雄诱导的PCOS模型大鼠的影响。LH、FSH反映PCOS具有较高的临床实用价值［9］。SHBG 和FAI是反映PCOS患者高雄状态的最佳指标，SHBG是调节体内雄激素水平、活性和雌雄激素比例的重要蛋白，其是重要的信号分子，在卵泡等生殖细胞发育成熟中起重要作用［10］。本研究发现Tan-I显著降低大鼠血清LH、LH/FSH和FAI的水平，显著升高大鼠血清FSH的表达水平，同时Tan-I显著升高大鼠卵巢组织中PPARG1水平，降低NCOR1和HDAC3 mRNA的表达水平。Tan-I对上述因子的改善作用呈剂量相关性。Tan-I通过改善大鼠血清LH、FSH、LH/FSH和FAI水平以及卵巢组织中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA的表达水平而达到治疗PCOS的目的。

［1］ Knochenhauer ES,Key TJ,Kahsar-Miller M,et al.Prevalence of the polycystic ovary syndrome in unselected black and white women of the southeastern United States: a prospective study.J Clin Endocrinol Metab,1998,83(9):3078-3082.

［2］ 朱瑄.丹参的实验药理研究进展.中国现代药物应用,2010,4(15):230-231.

［3］ 邓惠英.丹参及其有效成分的药理研究概况.现代医药卫生,2007,23(12):1812-1813.

［4］ Tamura N,Kurabayashi T,Nagata H, et al.Effects of testosterone on cancellous bone,marrow adipocytes,and ovarian phenotype in a young female rat model of polycystic ovary syndrome.Fertil Steril,2005,84 (Suppl 2):1277-1284.

［5］ Froment P,Gizard F,Staels B,et al.A role of PPARgamma in reproduction?Med Sci,2005,21(5):507-511.

［6］ Sepilian V,Nagamani M.Effects of rosiglitazone in obese women with polycystic ovary syndrome and severe insulin resistance.J Clin Endocrinol Metab,2005,90(1):60-65.

［7］ Alenghat T, Meyers K, Mullican SE, et al. Nuclear receptor corepressor and histone deacetylase 3 govern circadian metabolic physiology. Nature, 2008, 456(7224):997-1000.

［8］ Guenther MG,Barak O,Lazar MA.The SMRT and N-CoR corepressors are activating cofactors for histone deacetylase 3.Mol Cell Bio,2001,21(18):6091-6101.

［9］ Koskinen P,Penttila TA,Anttila L,et al.Optimal use of hormone determinations in the biochemical diagnosis of the polycystic ovary syndrome.Fertil Steril,1996,65(3):517-522.

［10］ Forges T,Gerard A,Hess K, et al.Expression of sex hormonebinding globulin（SHBG) in human granulosa-lutein cells.Mol Cell Endocrinol,2004,219(1-2):61-68.

Objective To explore the effects of Tanshinone I on the expression of sex hormones and ovarian functions in the model rat with PCOS induced by hyperandrogenism. Methods The PCOS model rats were established by injecting subcutaneously with testosterone propionate. The SD rats were randomly divided into normal group，PCOS+ high，medium，low dose of Tan-I and PCOS model group. Results Tan-I significantly decreased the serum levels of LH，LH/FSH，FAI，NCOR1mRNA as well as HDAC3mRNA and increased the serum levels of FSH，PPARG1mRNA expression，which were dose-dependent. Conclusions Tanshinone I can function well in curing PCOS through regulating the expression of sex hormones and ovarian functions in the model rat with PCOS induced by hyperandrogenism.

Tanshinone I Hyperandrogenism Polycystic ovary syndrome

浙江省中医药科技计划项目（2015ZB024）

310003 浙江大学医学院附属第一医院（陈夏凉 金悦）310006 浙江大学医学院附属妇产科医院（曲凡）*通信作者