CD8+T细胞表位鉴定技术研究进展

樊淑华，王永立

(1.周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口 466001; 2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

CD8+T细胞表位鉴定技术研究进展

樊淑华1,2，王永立1

(1.周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口 466001; 2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

CD8+T细胞表位通过MHCⅠ分子呈递到细胞表面，激活CTL细胞从而介导并调节机体抗内源性抗原的免疫应答。MHC-peptide稳定性试验通过TAP缺陷的RMAS细胞转染克隆在细胞水平鉴定CD8+T细胞表位与MHCⅠ分子的亲和力；酶联免疫斑点技术(ELISPOT)通过检测IFN-γ的分泌水平评估抗原免疫后机体的细胞免疫应答能力，具有较高的敏感性和高效性。四聚体技术通过流式细胞仪分析抗原特异性CD8+T细胞的表型和功能特征。论文介绍 了CD8+T细胞表位的特征和上述3种表位鉴定方法的基本原理和研究进展，为 CD8+T细胞表位的鉴定和表位疫苗的研制提供参考。

T细胞表位；CD8+T细胞；表位预测；表位鉴定

CD8+T细胞表位是内源性抗原经抗原提呈细胞(antigen presentation cell,APC)处理后，由主要组织相容性复合体 MHCⅠ(major histocompatibility complex class Ⅰ)分子递呈到细胞表面，供CD8+T细胞受体(T cell receptor，TCR) 识别的表位。细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocytes，CTL) 是CD8+T细胞的主要功能亚群。CTL免疫应答在机体抵抗胞内微生物感染和肿瘤发生的过程中起着重要作用，是机体发挥特异性细胞毒作用的主要效应细胞[1]。由于TCR对抗原的识别具有MHC限制性，CD8+T细胞受体只识别MHCⅠ分子递呈的表位肽[1]，这为CD8+T细胞表位研究提供了重要的理论基础。目前，研究T细胞表位的常用技术手段包括基于氨基酸序列或结构的表位预测、酵母双杂交[2]、噬菌体展示库[3]、MHC-肽四聚体[4]、快速蛋白液相色谱、圆二色谱、X-射线衍射和核磁共振等方法[5]。中国农业大学进化免疫学实验室通常按照以下3个主要程序筛选和鉴定动物病毒的CD8+T细胞表位：①首先根据抗原序列或抗原结构进行免疫优势表位的分析及合成；②将表位肽与MHC分子进行体外共复性，通过快速蛋白液相色谱和圆二色谱检测多肽与MHC分子的亲和力；③通过细胞学试验、酶联免疫斑点技术 (enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT ) 和四聚体技术鉴定表位多肽的生物学功能。本文着重从以上3个方面， 对CD8+T细胞表位分析鉴定技术的与原理和进展进行了论述。

1 CD8+T细胞表位的呈递和基本特征

根据T细胞表面CD4和CD8分子的表达，可将成熟的T细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。其中CD8+T细胞主要以 MHCⅠ类分子限制性方式识别靶细胞表面的特异性抗原，是机体发挥特异性细胞毒作用的主要效应细胞[1]。内原性抗原蛋白被细胞基质和细胞核中的蛋白酶体降解成多肽片段,被转运相关蛋白酶体(transporter associated with antigen processing，TAP)运送到粗面内质网(rough endoplasmic reticulum，RER)内与新合成的MHCⅠ类分子结合形成抗原肽-MHC Ⅰ复合物(peptide-MHCⅠ-β2m，pMHCⅠ)。pMHCⅠ复合物在RER内与轻链(β2 microglobulin，β2m)组装在一起，经高尔基体转运到细胞表面被CD8+T细胞所识别，发挥细胞免疫应答效应，这个过程叫做抗原的呈递。相反，如果多肽与MHCⅠ分子在粗面内质网中不能结合，则返回到细胞溶质中进行降解[6-7]。

分子生物学及结构免疫学技术的发展加深了人们对MHCⅠ分子及CD8+T细胞表位的认识。MHC Ⅰ分子由重链α和轻链β2m共同构成，重链胞外部分具有3个结构域，即α1、α2、α3，β2m通过非共价作用力与α链结合。α1和α2共同形成多肽结合槽,MHCⅠ分子通过多肽结合槽结合、呈递多肽表位。多肽结合槽内与多肽结合紧密的凹陷，被称为口袋，从N端到C端可以划分成A～F 6个口袋。一般来讲，B、F口袋(有些是B、C、F或者B、D、F)决定了MHCⅠ倾向于结合哪种性质的多肽序列。能够结合到以上口袋中多肽上的氨基酸被称为锚定残基[8]。由于MHCⅠ多肽结合槽两端呈封闭状，CD8+T细胞表位相对较短，一般为8肽～11肽。多肽表位的构象通常为M型[9]，但有些表位呈现特殊的双M型构象，即其第4、6、8位氨基酸残基伸出多肽结合槽外以结合TCR，第2、5、9位氨基酸残基插入多肽结合槽，并与多肽结合槽内的氨基酸形成不同的相互作用力[10]。这些结构学方面的信息和CD8+T细胞表位特征为细胞表位的预测分析和试验鉴定提供了理论依据。

2 T细胞表位预测方法

生物信息学预测T细胞表位的方法主要分为基于序列的预测方法和基于结构的预测方法[11-12]。其中基于序列的预测方法主要通过序列同源性分析，通过MHCⅠ分子与病毒表位的结合阈值预测表位的亲和力，常用网站包括NetMHCpan2.8server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-2.8/) 和SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)[13-14]。基于结构的预测方法是利用MHC Ⅰ分子的晶体结构及蛋白-多肽相互作用的具体信息来模建3D 模型，通过分析其三维构象和多肽结合槽特征，并结合相似构象的MHCⅠ限制性T细胞表位来预测新的表位。但通过生物信息学方法进行多肽筛选存在较多的假阳性[15]，需要通过进一步的生物学试验对多肽的生物学功能进行鉴定。

3 CD8+T细胞表位的鉴定

体外共复性试验是目前常用的CD8+T细胞表位的鉴定方法，该方法将表位肽与相应MHC分子进行体外共复性，通过快速蛋白液相色谱 (fast protein liquid chromatography，FPLC)和圆二色谱技术来检测多肽与MHC分子的亲和力。如Fan S等[5]应用分子筛和离子交换色谱技术鉴定了黑山猪HLA-3*hs0202结合A型流感病毒的CD8+T细胞表位。该方法可实现对预测T细胞表位的高通量鉴定，但无法确定表位的体内生物学活性。因此，常常需要通过细胞学试验或动物试验鉴定多肽的功能。

3.1 MHC-peptide稳定性试验

MHC-peptide稳定性试验是用来检测某一多肽对细胞表面MHC分子亲和力的研究。该方法应用TAP缺陷的细胞系如人类的T2细胞或变异的小鼠淋巴瘤细胞系 (Rauscher virus induced mouse antigen processing-defective mutant cell line-ethylmethane sulphonate, RMA-S)来检测pMHC的稳定性。由于TAP缺陷，T2细胞和RMA-S细胞内源性多肽不能转运至内质网，不能与MHC分子进行组装并转运到细胞表面，所以细胞表面空载的MHC分子表达极不稳定，表达后很快被降解[16]。但是，在外源性多肽的作用下，细胞表面的pMHC复合物能够稳定表达于细胞表面，抗原肽与MHC的结合力越强，则细胞表面MHC分子的降解就越少，表现为表达量越高。结果可通过间接免疫荧光法检测，两者结合越稳固，可检测到的MHCⅠ类分子越多，最终以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数作为衡量指标[17]。

近年来，MHC-peptide稳定性试验在人及动物病毒CD8+T细胞表位的鉴定中广泛应用。2010年，Macdonald IK等将真核表达的牛N*01301- pcDNA6转染到细胞中，并应用该细胞系对牛的免疫优势表位(Tp1214-224：VGYPKVKEEML)进行了生物学特性的研究，证明多肽第5位(Lys)和第11位(Leu)为决定多肽功能的关键位点[17]。2012年，Ross P等[18]将狗的MHC分子 DLA-88*50801 转染到 RMA-S 细胞中，通过G418抗性筛选到了1株稳定表达DLA-88*50801基因的克隆BARC3，并应用BARC3细胞成功筛选了DLA-88*50801限制性CD8+CTL表位。研究结果表明，外源多肽可以稳定RMA-S细胞表面MHC分子的组装和表达，且细胞外异种β2m能使低温培养的的RMA-S细胞表面的MHCⅠ分子表达量增加，低温(19℃～33℃)更有利于MHC复合体的组装。通过 MHC-peptide稳定性试验可以从细胞学水平证明多肽表位能否被相应 MHCⅠ分子呈递到细胞表面，以发挥其细胞免疫的功能。

3.2 酶联免疫斑点技术

酶联免疫斑点技术将细胞培养技术与酶联免疫吸附(ELISA试验)相结合，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其原理是用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来[19]。试验设计在96孔培养板上进行，培养板预先包被特异性的单克隆抗体，以捕获细胞分泌的细胞因子，再加入生物素包被的第二抗体和辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素，最后加入底物，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。根据膜上斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。

ELISPOT技术通过体外检测CD8+T细胞因子的分泌水平，来评估抗原免疫后机体的细胞免疫应答能力，该方法可实现对T细胞表位肽的的高通量筛选和鉴定[20]。如Schultheis K等[21]应用ELISPOT技术检测了DNA疫苗免疫后机体特异性细胞应答水平，并鉴定了一些蛋白免疫优势T细胞表位。Assarsson E 等[15]预测了23个A型流感病毒株的4 000 个表位肽，通过ELISPOT技术鉴定了这些多肽与人类MHC(human leucocyte antigen，HLA)超级型之间的亲和力，鉴定出54个能够与不同HLA分子结合的保守流感表位，为通用流感表位疫苗的研制提供了依据。Diaz I等[22]应用生物信息学方法预测了欧洲Ⅰ型PRRSV GP4、GP5和N蛋白的T细胞表位，并采用ELISPOT试验鉴定出PRRSV N 蛋白和GP4蛋白的5条免疫优势T细胞表位，证明N蛋白与GP4和GP5蛋白相比，在细胞免疫应答中具有更重要的作用。Lima-Junior J C等[23]应用ELISPOT技术检测了巴西西北部的亚马逊森林区142人外周血淋巴细胞内的IFN-γ和IL-4水平，鉴定了间日疟原虫表面蛋白(Plasmodiumvivaxmerozoite surface protein ，PvMSP9) 的免疫优势T细胞表位。Eickhoff C S等[24]通过ELISPOT技术鉴定了32个HLA-A2 限制性克氏锥虫(Trypanosomacruzi)CD8+T细胞表位。

通过ELISPOT技术检测机体内细胞因子(IFN-γ和IL-4)产生的水平是评估病原感染后细胞免疫应答能力的关键，也是评估多肽免疫原性的依据。通过ELISPOT技术鉴定多肽的生物学活性，为新型表位疫苗的研制提供了数据支持。

3.3 四聚体技术

四聚体技术是基于MHC-抗原肽复合物与T细胞表面受体(TCR)相互作用的原理而设计的。由于MHC-抗原肽与TCR的亲和力低且解离速度快[25]，不能在细胞表面形成稳定的复合物，因此不适于抗原特异性T细胞的分析。1996年，Altman J D等[26]发明了MHC/多肽四聚体技术并将其应用于人类免疫缺陷病毒抗原肽特异性CTL的检测中获得成功。该技术借助生物素-亲和素级联反应放大原理，将4个生物素化后的 MHCⅠ-肽复合物与1个链酶亲和素结合作为 TCR 识别的配体，增强了MHC-多肽与TCR的亲和力，并提高了反应的特异性。同时，将四聚体进行荧光标记，应用流式细胞仪可将抗原特异性的T细胞检测并分离出来，提高了灵敏度。

目前，四聚体技术在抗胞内微生物免疫领域主要用于抗原特异性T细胞免疫应答的监控和T细胞表位的筛选。如 Wu Y等[27]构建了 HLA-A*02乙型肝炎病毒(HBV) 肽四聚体，用于检测乙型肝炎病人外周血中HBV 特异性 CTL细胞，证明利用四聚体技术可对外周血中病毒特异性T淋巴细胞水平进行评估，从而验证多肽的的生物学功能。Chiu C等[28]应用四聚体技术鉴定了人HLA-A*0201限制性水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus，VZV) 的一个免疫优势CD8+T细胞表位，分析了多肽特异性CD8+T细胞的功能，并证明了该表位对α疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)和β疱疹病毒具有交叉免疫性，为保守的病毒特异性表位疫苗的研制提供了依据。

另外，该技术在寄生虫T细胞表位的研究中也得到了广泛的应用。Svitek N等[29]报道了牛MHCⅠ(bovine leukocyte antigens，BoLAⅠ)四聚体的应用，将7个不同的BoLAⅠ分子与来自泰勒氏虫(Theileriaparva，Tp)5种不同抗原的7个表位同时制备了四聚体复合物，并应用该四聚体复合物检测了免疫15 d～17 d后牛外周血中表位特异性T细胞，发现多肽表位Tp587-95 特异性CTL可同时识别Tp5-BoLA-1*02301和Tp5-BoLA-T5两种四聚体，从而证明了多肽表位Tp587-95可被不同的BoLA Ⅰ分子呈递。Lasso P等[30]通过四聚体技术检测了锥虫病感染病人体内的双阳性T淋巴细胞，评估了克氏锥虫 KMP-11 蛋白中的保守九肽(Tc TLE)诱导HLA-A2、HLA-A24 和HLA-A1 3个MHC超级型人群中的CD8+T细胞免疫应答的能力，鉴定了Tc TLE多肽的生物学功能。Sanecka A等[31]制备了刚地弓形虫Ld -Gra6四聚体，鉴定了弓形虫急性和慢性感染期CD8 T细胞免疫优势表位。

MHCⅠ四聚体技术可以通过流式细胞仪直接对特异性CTL 进行定量、定性分析，提高了检测的灵敏度和特异性，是目前检测抗原特异性CTLs 的金标准。本课题组致力于动物MHCⅠ类分子四聚体的研究，利用四聚体技术更好地筛选抗胞内微生物的CD8+T 细胞表位多肽，并希望在牛源寄生虫病多肽疫苗的研制方面取得突破。

4 展望

目前，疫苗免疫仍是机体抵御病毒和胞内寄生虫感染的有效措施。然而还有许多病原生物至今还缺乏有效的疫苗，如人畜共患隐孢子虫病[32-33]。细胞表位疫苗在预防肿瘤及开发免疫治疗性疫苗方面已显露出广阔的应用前景。随着结构生物学及免疫学技术的成熟，多种T细胞表位的预测和鉴定方法也随之建立起来。四聚体和ELISPOT技术以其高效和高通量的优势逐渐成为免疫学基础研究与新型疫苗开发的常规手段。但由于T细胞表位分子质量较小，免疫原性较弱，如何提高其免疫原性是表位疫苗研究的关键。将不同类型的保守T细胞表位进行融合构建通用型表位疫苗、开发新型免疫佐剂以提高表位疫苗的免疫原性是表位疫苗研究的重要方向。本文围绕细胞表位的预测与鉴定技术，阐述了CD8+T细胞表位研究的现状，希望对T细胞表位的鉴定及T细胞表位疫苗的研制提供参考。

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Abstract:CD8+T cell epitopes submitted by MHCⅠ molecules can stimulate CTL cells,and play a crucial role in mediating and regulating immunoreactions against endogenous antigens.The binding of peptides to MHCI molecule could be detected using a stably transfected clone of TAP-deficient RMA-S; The IFN-gamma secretory ELISPOT (enzyme-linked immunospot) assay was found to be more sensitive and cost-effective compared to other methods and widely used on the detection of cell immune responses to immunization; Flow cytometry was used to examine the surface markers and biological function of antigen-specific CD8+T cell with MHC class Ⅰ peptide tetramers.This article reviewed the latest progress on the three techniques of experimental identification of CD8+T cell epitopes and its application for facilitating the development of epitope vaccines.

Keywords:T cell epitope; CD8+T cell; epitope prediction; epitope mapping

ProgressonCD8+TCellEpitopeMappingTechniques

FAN Shu-hua1,2,WANG Yong-li1

(1.CollegeofLifeScienceandAgronomy,ZhoukouNormalUniversity,Zhoukou,Henan,466001,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

S852.43

A

1007-5038(2017)08-0085-05

2017-01-16

国家863计划项目 (2013AA102503)；河南省科技厅科技发展计划项目(162102310587)；周口师范学院高层次人才启动项目 (700-70161)

樊淑华(1980-)，女，河南商丘人，讲师，博士，主要从事分子免疫学研究。