miR-497-5p对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用及机制

张君，高兰阳，詹平，毛熙光

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

miR-497-5p对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用及机制

张君，高兰阳，詹平，毛熙光

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

目的 探讨miR-497-5p对人宫颈癌细胞(HeLa)增殖的抑制作用及机制。方法 将对数生长期人宫颈癌HeLa细胞随机分为两部分，第一部分细胞随机分为四组：miR-497-5p mimics NC+IKCa1 3′端非翻译区(3′-URT)野生型双荧光素酶重组质粒载体(IKCa1-wt)转染组、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt转染组、miR-497-5p mimics NC+3′-URT突变型双荧光素酶重组质粒载体(IKCa1-mut)转染组、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut转染组，分别转染相应质粒48 h，用双荧光素酶报告基因检测系统检测HeLa细胞荧光素酶活性。第二部分细胞随机分为三组：miR-497-5p mimics转染组、miR-497-5p mimics NC转染组和空白对照组，分别转染相应质粒，用qRT-PCR技术检测细胞IKCa1 mRNA表达，Western boltting法检测细胞IKCa1蛋白表达，CCK-8法检测细胞增殖能力。结果 第一部分细胞中的miR-497-5p mimics+IKCa1-wt转染组荧光素酶活性较其他三组降低(P均<0.05)，其他三组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)，证实miR-497-5p与IKCa1 3′-URT存在特异性结合位点。第二部分细胞中的miR-497-5p mimics转染组IKCa1 mRNA、蛋白的相对表达量较其他两组降低(P均<0.05)，其他两组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。第二部分细胞培养24、48、72、96 h，miR-497-5p mimics转染组增殖能力均较其他两组降低(P均<0.05)，其他两组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 miR-497-5p可以通过负向调控IKCa1基因表达以抑制宫颈癌细胞增殖。

子宫颈癌；微小RNA-497-5p；中电导钙激活性钾离子通道；IKCa1基因；HeLa细胞；细胞增殖

中电导钙激活性钾离子通道(IKCa1)在人体广泛分布，通过影响细胞内钙离子浓度和细胞膜电位，调节细胞生理、病理活动。目前证实IKCa1基因在乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝细胞癌等恶性肿瘤组织中高表达[1～4]，参与肿瘤细胞的增殖、转移和肿瘤血管形成[5]。前期研究[6,7]也发现，IKCa1基因在宫颈癌组织呈高表达，但其高表达的机制尚不清楚。微小RNA(miRNA)是一类高度保守的非编码小RNA，在转录后水平调节靶基因的表达，从而影响细胞的生物学行为[8]，在调节恶性肿瘤基因表达中发挥重要作用。为了解IKCa1在宫颈癌中高表达的机制，2016年4～10月，本研究采用双荧光素酶报告基因检测系统、qRT-PCR技术、Western blotting技术鉴定IKCa1是否为miR-497-5P的靶基因，初步探讨miR-497-5p是否能通过靶向调控IKCa1基因影响HeLa细胞增殖。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人宫颈癌HeLa细胞株由西南医科大学中心实验室提供；胎牛血清购自杭州四季清；RPMI1640细胞培养液购自美国Gibco；Lipofectamin2000转染试剂购自美国Invitrogen；IKCa1 3′端非翻译区(3′-URT)的野生型和突变型双荧光素酶重组质粒载体(IKCa1-wt、IKCa1-mut)、miR-497-5p模拟物(miR-497-5p mimics)、miR-497-5p 模拟物阴性对照(miR-497-5p mimics NC)，均由上海吉玛制药构建合成；双Luciferase报告基因检测系统试剂盒购于Promega；总RNA提取试剂盒购于北京天根；Rever Tre Ace qPCR RT Master Mix和SYBR Green RT-PCR Master Mix购于TOYOBO；PCR引物由上海生工合成；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京凯基生物；IKCa1、β-actin抗体及二抗购于英国Abcam；CCK-8试剂盒购于日本同仁化学研究所。采用Targetscan、starBase、miRanda、miRDB在线搜索可能与IKCa1 3′-URT结合的miRNA，发现IKCa1 3′-URT与miR-497-5p存在互补配对序列，提示IKCa1可能为miR-497-5p的靶基因。

1.2 HeLa细胞分组及转染 将对数生长期的HeLa细胞随机分为两部分。第一部分HeLa细胞按1×105/孔接种于24孔培养板中培养，随机分为四组，miR-497-5p mimics NC+IKCa1-wt转染组、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt转染组、miR-497-5p mimics NC+IKCa1-mut转染组、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut转染组。第二部分HeLa细胞按照3×105/孔接种于6孔培养板中培养，随机分为三组：miR-497-5p mimics转染组、miR-497-5p mimics NC转染组和空白对照组。将各培养板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养24 h。按照转染试剂说明书，配制转染混合液，利用Lipofectamin2000，每孔转染适量相应的双荧光素酶报告载体和(或)miRNA。转染6 h后，弃转染液，加入适量新鲜不含抗生素的培养基，继续培养，用于后续实验。

1.3 HeLa细胞内双荧光素酶活性检测 采用双荧光素酶报告基因检测系统。第一部分HeLa细胞转染48 h后，去除培养基，PBS洗涤3次，1×PLB裂解液按照100 μL/孔加入24孔培养板中，室温轻缓晃动培养板15 min。每孔取裂解产物20 μL置于检测板中，按照30 μL/孔加入LARⅡ试剂，于多功能酶标仪上检测萤火虫荧光素酶活性。取出检测板，每孔加入Stop & Glo Reagent试剂30 μL，于多功能酶标仪上检测海肾荧光素酶活性。实验独立重复3次，记录相关数据。荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.4 HeLa细胞内IKCa1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR技术。第二部分HeLa细胞转染48 h，按照RNA提取试剂盒步骤提取细胞总RNA，NanoDrop ND-1000测定及变性琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA质量。质量合格的RNA逆转录合成cDNA于-20 ℃保存备用，逆转录条件为：37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min。按照荧光定量试剂说明加入相应组分，反应体系20 μL。IKCa1上、下游引物：5′-GCAGGAACTGGCATTGGACT-3′、5′-CTGATCGTGCATTTAACCAGGA3′，GAPDH上、下游引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG3′、5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA3′。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、56 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s 40个循环，95 ℃ 10 s，72 ℃ 5 s，95 ℃ 10 s。实验独立重复3次，采用2-ΔΔCt法计算IKCa1 mRNA相对表达量。

1.5 HeLa细胞内IKCa1蛋白表达检测 采用Wertern boltting法。第二部分HeLa细胞转染72 h后提取细胞总蛋白。将总蛋白分为两部分，一部分进行蛋白浓度测定，一部分加入适量5×Loding buffer混匀，沸水浴5 min后-80 ℃保存备用。取等量细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，TBST洗膜1次。5%脱脂奶粉封闭，摇床摇晃2 h后，TBST洗膜3次，加入封闭液稀释好的一抗(IKCa1 1∶200，β-actin 1∶5 000)，4 ℃摇床孵育过夜。室温摇床使之恢复室温，TBST洗膜3次，加入稀释好的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，化学发光后凝胶成像系统成像，保存图片。重复实验3次。采用Quntity One软件测得灰度值，以目的蛋白灰度值/内参灰度值作为目的蛋白相对表达量。

1.6 HeLa细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。第二部分HeLa细胞转染48 h，经胰酶消化，收集细胞，将其按照6×103/孔接种于96孔培养板中，设置调零孔，每组5个复孔，置于恒温箱中培养。分别培养24、48、72、96 h，更换培养基，每孔加入CCK-8试剂10 μL，避光培养2 h，用酶标仪于450 nm波长测吸光度值(OD值)，OD值与细胞数呈正比，以此评估细胞增殖能力。重复实验3次，取平均值。

2 结果

2.1 miR-497-5p与IKCa1 3′-URT相互作用对荧光素酶活性的影响 miR-497-5p mimics NC+IKCa1-wt转染组、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt转染组、miR-497-5p mimics NC+IKCa1-mut转染组、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut转染组荧光素酶活性分别为0.015 2±0.000 3、0.007 1±0.000 1、0.015 1±0.000 4、0.015 0±0.000 4。miR-497-5p mimics+IKCa1-wt转染组荧光素酶活性较其他三组降低(P均<0.05)，其他三组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。证实miR-497-5p与IKCa1 3′-URT存在特异性结合位点。

2.2 miR-497-5p 对HeLa细胞内IKCa1 mRNA表达的影响 空白对照组、miR-497-5p mimics NC转染组、miR-497-5p mimics转染组IKCa1 mRNA的相对表达量分别为1.000±0.000、1.135±0.153、0.395±0.070。miR-497-5p mimics转染组IKCa1 mRNA相对表达量较其他两组降低(P均<0.05)，其他两组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.3 miR-497-5p 对HeLa细胞内IKCa1蛋白表达的影响 空白对照组、miR-497-5p mimics NC转染组、miR-497-5p mimics转染组IKCa1蛋白的相对表达量分别为0.869±0.019、0.939±0.044、0.425±0.021。miR-497-5p mimics转染组IKCa1蛋白相对表达量较其他两组降低(P均<0.05)，其他两组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.4 miR-497-5p 对HeLa细胞增殖能力的影响 培养24、48、72、96 h，miR-497-5p mimics转染组OD值均较其他两组降低(P均<0.05)，其他两组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组不同培养时间细胞增殖能力比较

3 讨论

IKCa1是钙激活钾离子通道家族中的重要成员之一，由定位于19号染色体q13.2区的IKCa1基因编码，在调节细胞生理功能和细胞分子信号转导通路中发挥重要作用。近年来大量研究证实，IKCa1参与多种恶性肿瘤发生发展过程。Haren等[1]发现，IKCa1在乳癌组织和乳腺癌细胞中表达上调，与乳腺癌分期、分化程度及转移密切相关。Lallet-Daher等[3]在研究中发现，前列腺癌组织中IKCa1基因呈高表达，IKCa1特异性阻断剂TRAM-34阻断IKCa1通道后，p21表达水平升高，从而抑制前列腺癌细胞增殖。Wang等[2]通过小鼠在体试验证实，阻断IKCa1通道能抑制子宫内膜癌的生长。Zhang等[9]利用shRNA技术沉默IKCa1基因和TRAM-34阻断IKCa1通道后，细胞周期素D1、细胞周期素E、存活素表达降低，子宫内膜癌细胞周期阻滞在G0～1期；同时发现基质金属蛋白酶2的表达水平下降，从而抑制子宫内膜癌细胞迁移和侵袭。我们前期研究中也证实IKCa1在宫颈癌中高表达[6，7]，克霉唑阻断IKCa1通道后，IKCa1 mRNA表达下调，并抑制HeLa细胞增殖[10]，提示IKCa1基因参与了宫颈癌的发生发展，然而IKCa1高表达的机制尚不明确。

近年研究发现，miRNA调控人类1/3以上的基因，超过一半的miRNA基因位于肿瘤相关的染色体或其脆性位点上，与肿瘤的发生发展相关[11]，发挥着癌基因或抑癌基因的作用。目前已证实，宫颈癌及其癌前病变与高危型人类乳头瘤病毒(HPV)持续感染密切相关。有研究[12]显示，miR-497-5p在宫颈癌组织中呈现低表达，与高危型HPV感染密切相关。因此，对miR-497-5p与IKCa1基因是否存在靶向关系的探讨，可能有利于了解IKCa1基因在宫颈癌发生发展中的意义及作用机制。

目前鉴定miRNA靶基因的方法主要有两类：一类是生物信息学方法，操作简单方便，但仍存在假阳性的可能；一类是生物学实验方法，包括双荧光素酶报告基因、RNA检测和Wertern boltting技术，准确率高。本研究采取生物学实验来鉴定IKCa1是否为miR-497-5P的靶基因。miRNA mimics是用化学合成方法合成的，通过模拟生物体内源的miRNA，增强内源性miRNA的表达。本研究通过转染miR-497-5p mimics来上调HeLa细胞中miR-497-5p表达水平。miRNA主要通过与靶基因mRNA 3′-URT区的互补序列完全或不完全结合而发挥作用。利用双荧光素酶报告基因系统来检测miR-497-5p与IKCa1 mRNA 3′-URT 是否存在互补序列。荧光素酶活性检测显示共转染miR-497-5p mimics和IKCa1-wt后，HeLa细胞荧光素酶活性降低，初步证实IKCa1为miR-497-5p的靶基因之一，为miR-497-5p靶向调控IKCa1基因提供了结构学依据。miRNA调控基因表达的主要方式是以完全互补或不完全互补结合目的基因mRNA 3′-URT，导致mRNA降解，从而抑制蛋白质合成。因此我们采用qRT-PCR、Wertern boltting法检测各组IKCa1 mRNA及蛋白表达，发现转染了miR-497-5p mimics的HeLa细胞中IKCa1 mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组降低，提示miR-497-5p可负向调控IKCa1的表达，从而为miR-497-5p靶向调控IKCa1基因提供了功能学依据。

本研究通过CCK-8法检测发现，转染了miR-497-5p mimics的HeLa细胞增殖活性降低，提示miR-497-5p可抑制HeLa细胞增殖活性，可能与miR-497-5p负向调控IKCa1基因有关。同时，与我们前期研究中发现阻断IKCa1通道能抑制HeLa细胞增殖的结论相符。

综上所述，miR-497-5p可以抑制HeLa细胞增殖，这可能是通过下调IKCa1表达实现的。

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Inhibitory effect of miR-497-5p on proliferation of human cervical carcinoma cell

ZHANGJun,GAOLanyang,ZHANPing,MAOXiguang

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the inhibitory effect and mechanism of miR-497-5p on proliferation of human cervical cancer HeLa cells. Methods The human cervical cancer HeLa cells in the logarithmic growth phase were randomly divided into two parts. The first part was randomly divided into 4 groups: miR-497-5p mimics NC and IKCa1-wt co-transfection group, miR-497-5p mimics and IKCa1-wt co-transfection group, miR-497-5p mimics NC and IKCa1-mut co-transfection group and miR-497-5p mimics and IKCa1-mut co-transfection group which were transfected by corresponding plasmids for 48 h. The luciferase activity of HeLa cells was detected by double luciferase reporter assay system. The second part was randomly divided into 3 groups: miR-497-5p mimics transfection group, miR-497-5p mimics NC transfection group and blank control group. Cells in each group were transfected with Lipofectamin 2000. The expression of IKCa1 mRNA was detected by qRT-PCR, IKCa1 protein expression was detected by Western blotting and the proliferation ability of HeLa cells was measured by CCK-8 assay. Results The luciferase activity of miR-497-5p mimics and IKCa1-wt co-transfection group was lower than that of the other three groups of the first part (allP<0.05), and no significant difference among other three groups ( allP>0.05), which confirmed that miR-497-5p and IKCa1 3 '-URT had specific binding sites. The expression of IKCa1 mRNA and protein of the miR-497-5p mimics transfection group was lower than that of the other two groups of the second part (allP<0.05), and there was no significant difference between the other two groups (allP>0.05). The proliferation ability of the miR-497-5p mimics transfection group was lower than that of the other two groups at 24, 48, 72 and 96 h of culture (allP<0.05), and there was no significant difference between the other two groups (allP>0.05). Conclusion miR-497-5p can inhibit the proliferation of cervical cancer HeLa cells by negatively regulating the expression of IKCa1 gene.

cevical carcinoma; micro RNA-497-5p; intermediate-conductance-Ca2+-activated K+channel; IKCa1 gene; HeLa cells; cell proliferation

四川省卫生厅科研基金资助项目(110373)；四川省泸州市科技局科研项目(2013LZLY-J30)。

张君(1988-)，女，硕士在读，主要研究方向为妇科肿瘤。E-mail：446358256@qq.com

毛熙光(1965-)，男，硕士，教授，主要研究方向为妇科肿瘤。E-mail：mxg6639@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.005

R737.33

A

1002-266X(2017)05-0015-04

2016-11-10)