蕨麻多糖对缺氧损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及机制

葛肖健，张永亮，师超峰，徐葳，李建宇， 李灵芝

(1天津中医药大学，天津300193；2武警后勤学院；3天津市职业与危害防制重点实验室)

蕨麻多糖对缺氧损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及机制

葛肖健1,2，张永亮2,3，师超峰2，徐葳2，李建宇2， 李灵芝2,3

(1天津中医药大学，天津300193；2武警后勤学院；3天津市职业与危害防制重点实验室)

目的 探讨蕨麻多糖对缺氧损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及机制。方法 将培养好的人脐静脉内皮细胞株EA.hy926随机分为常氧对照组、缺氧模型组、复方丹参对照组及蕨麻多糖高、中、低浓度组，除常氧对照组外，其余5组构建缺氧损伤模型，同时复方丹参对照组加复方丹参片提取物(终浓度0.1 mg/mL)，蕨麻多糖高、中、低浓度组加终浓度分别为0.1、0.05、0.025 mg/mL的蕨麻多糖，均培养2 h。采用MTT法检测细胞活力，采用台盼蓝染色法测算细胞存活率，光学显微镜下观察细胞形态变化，用比色法测定细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)水平，ELISA法测定培养基中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素1(ET-1)水平，比色法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平，RT-PCR技术测定细胞内iNOS、eNOS mRNA表达。结果 蕨麻多糖各浓度组、复方丹参组与缺氧模型组比较细胞形态均有不同程度改善。与缺氧模型组比较，蕨麻多糖各浓度组、复方丹参组细胞活力及存活率升高，细胞LDH外漏量下降，iNOS和ET-1水平降低，eNOS和NO水平升高，SOD水平升高，MDA水平降低，细胞eNOS mRNA表达升高，iNOS mRNA表达降低(P均<0.05)。结论 蕨麻多糖可能通过提高缺氧损伤EA.hy926细胞的抗氧化活性、调控ET-1与NO的动态平衡发挥保护作用。

缺氧损伤；蕨麻多糖；脐静脉内皮细胞；一氧化氮；内皮素

蕨麻为蔷薇科委陵菜属鹅绒委陵菜的地下块根。课题组前期研究证实，蕨麻对心肌细胞[1]、神经细胞[2]、内皮细胞缺氧损伤[3]及急性低压缺氧和慢性缺氧导致的机体损伤[4]均有显著的抗缺氧作用。初步研究还发现，蕨麻多糖可减轻缺氧导致的心肌细胞损伤，并能延长常压缺氧状态下小鼠的存活时间[5]，提示蕨麻多糖可能是蕨麻重要的抗缺氧有效成分。2014年3月～2015年12月，本研究通过建立人脐静脉内皮细胞缺氧损伤模型，探讨蕨麻多糖对缺氧损伤内皮细胞的保护作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器 蕨麻(青海)；蕨麻多糖，由本实验室自行提取；复方丹参片(天津亚宝药业科技有限公司)，有效成分按药典方法提取。人脐静脉内皮细胞株EA.hy926(中科院上海细胞库)。乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程公司)；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素1(ET-1)检测试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)；iNOS、eNOS及β-actin引物均由上海捷瑞生物公司合成；高糖DMEM培养基(美国GIBCO公司)。CO2培养箱(3111型，美国Thermo forma)，混合气体培养箱(3131型，美国Thermo forma)，倒置显微镜(TS100型，日本Olympus)，紫外分光光度仪(UV-1800型，日本岛津)，多功能显微镜(E-510型，日本Olympus)，酶标仪(680型，美国Bio-Rad)，PCR仪(PT-0200型，美国MJ Research)，核酸定量仪(德国Eppendorf)，凝胶成像分析系统(GelPro 4.5型，美国)。

1.2 细胞培养、分组及缺氧损伤模型构建 EA.hy926细胞培养于DMEM培养液，内含10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mg 链霉素，于37 ℃、5% CO2环境培养。待细胞生长至80%融合时，消化并接种至培养皿继续培养。待细胞融合度达90%时，将培养液换为无血清DMEM继续培养24 h，将细胞分为常氧对照组、缺氧模型组、复方丹参对照组及蕨麻多糖高、中、低浓度组。弃上清液，除常氧对照组外，其余5组换预先用5% CO2、95% N2饱和了30 min的无糖无血清培养液，同时复方丹参对照组加入复方丹参片提取物(终浓度0.1 mg/mL)，蕨麻多糖高、中、低浓度组加入蕨麻多糖(终浓度分别为0.1、0.05、0.025 mg/mL)，于37 ℃下混合气体培养箱中培养。常氧对照组弃上清液，换等体积含0.5% DMSO的培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中同步培养。

1.3 细胞活力检测 采用MTT法。取各组细胞接种于96孔板，培养2 h后弃上清液，每孔加入MTT溶液20 μL，继续在37 ℃、5% CO2环境下孵育4 h，加150 μL/孔DMSO充分溶解，于492 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，细胞活力=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4 细胞存活率测算 采用台盼蓝染色法。取各组细胞接种于6孔板，培养2 h后弃上清液。PBS浸洗细胞，加入PBS稀释的0.4%台盼蓝染液染色5 min后吸去染液，PBS浸洗2次，镜下观察并计数蓝染细胞，计算细胞存活率。细胞存活率=(细胞总数-蓝染细胞数)/细胞总数×100%。

1.5 细胞形态学观察 将盖玻片置于6孔培养板内，待细胞爬片后取出，以0.01 mol/L PBS洗涤，95%乙醇固定，按常规HE染色法染色，光学显微镜下观察细胞形态。

1.6 细胞培养基中LDH、NO、iNOS、eNOS、ET-1水平检测 取各组细胞接种于24孔板，培养2 h，用比色法测定细胞培养基中LDH、NO水平，ELISA法测定培养基中iNOS、eNOS、ET-1水平。操作按试剂盒说明书进行。

1.7 细胞内SOD、MDA水平检测 取各组细胞接种于24孔板，培养2 h加0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心10 min后去上清液，加0.01 mol/L PBS 1 mL制成细胞悬液，超声破碎细胞后，比色法测定细胞内SOD、MDA水平。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.8 细胞内iNOS、eNOS mRNA表达检测 采用RT-PCR技术。提取各组内皮细胞总RNA，逆转录合成cDNA。根据GenBank库序列设计内参β-actin及目的基因iNOS、eNOS的引物，进行逆转录产物的PCR扩增。iNOS上游：5′-GAGGAAGTGGGCAGGAGAATG-3′，下游：5′-GTAGTAGA AAGGGGACAGGAC-3′，扩增产物长度为294 bp。PCR反应条件：94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min。eNOS上游：5′-GCACAGGAAATGTTCACCTAC-3′，下游：5′-GTATCCAGGTCCATGCAGAC -3′，扩增产物长度为551 bp。PCR反应条件：94 ℃ 45 s，62 ℃ 45 s，72℃ 30 s，28个循环，72 ℃延伸5 min。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，凝胶成像分析系统检测各扩增条带A值，目的基因mRNA相对表达量=目的基因扩增条带A值/内参β-actin扩增条带A值。

2 结果

2.1 蕨麻多糖对缺氧细胞活力及存活率的影响 见表1。

表1 各组细胞代谢活力及存活率比较

注:与常氧对照组比较，aP<0.05；与缺氧模型组比较，bP<0.05。

2.2 蕨麻多糖对缺氧细胞形态的影响 常氧对照组内皮细胞呈梭形，细胞核大而饱满，胞质丰富，细胞呈紧密排列；缺氧模型组可见细胞发生皱缩，胞体变小，细胞核固缩深染，细胞之间联系减少，间隙增大，且可见少数肿大淡染细胞；蕨麻多糖各浓度组、复方丹参组与缺氧模型组比较细胞形态均有不同程度改善。

2.3 蕨麻多糖对缺氧细胞LDH外漏及合成释放NO、ET-1能力的影响 见表2。

2.4 蕨麻多糖对缺氧细胞内SOD、MDA水平的影响 见表3。

2.5 蕨麻多糖对缺氧细胞内 eNOS、iNOS mRNA表达的影响 见表4。

表2 各组培养基中LDH、NO、iNOS、eNOS、ET-1水平比较

注:与常氧对照组比较，aP<0.05；与缺氧模型组比较，bP<0.05。

表3 各组细胞内SOD、MDA水平比较

注:与常氧对照组比较，*P<0.05；与缺氧模型组比较，bP<0.05。

表4 各组细胞内eNOS、iNOS mRNA相对表达量比较

注:与常氧对照组比较，*P<0.05；与缺氧模型组比较，bP<0.05。

3 讨论

近年来研究发现，天然多糖具有抗肿瘤、降糖、降脂、抗凝、抗衰老、抗辐射、抗缺氧、抗氧化等诸多生物活性[6]。多糖在蕨麻中占很大比例，蕨麻多糖对体外培养缺氧损伤心肌细胞具有保护作用[5]，提示多糖可能是蕨麻抗缺氧的重要活性成分。本研究结果显示，蕨麻多糖能显著减少缺氧内皮细胞LDH外漏，增强细胞活力和提高细胞存活率，表明蕨麻多糖能减轻缺氧导致的细胞膜损伤，对缺氧损伤内皮细胞具有保护作用。超氧化物歧化酶(SOD)是体内清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，SOD的活性可反映机体清除自由基的能力。丙二醛(MDA)是膜脂质过氧化的最终产物，是自由基对脂类损害的结果。本研究结果显示，缺氧模型组内皮细胞SOD活性降低，MDA水平升高，表明缺氧导致了细胞抗氧化能力下降，发生了脂质过氧化损伤。给予不同浓度蕨麻多糖处理后，细胞SOD活性均升高，同时MDA的产生减少。说明蕨麻多糖可通过提高细胞的抗氧化能力对抗缺氧损伤。有文献报道蕨麻多糖可通过清除自由基，提高大鼠抗氧化能力，从而对抗地塞米松导致的免疫抑制[7]；蕨麻多糖在脑缺血再灌注模型中也可提高大鼠脑组织SOD、谷胱甘肽水平，减少MDA产生[8]，进一步为本研究结果提供了佐证。蕨麻正丁醇部位可提高缺氧EA.hy926细胞SOD活性，降低MDA水平，减少低密度脂蛋白和肌酸激酶的释放，提示在其中占有很大比例的蕨麻多糖也可能发挥了作用。

体内NO的合成受一氧化氮合酶(NOS)的调控，该酶有神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、eNOS和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)三种亚型，其中nNOS和eNOS催化产生的NO量少，主要参与生理过程。在正常状态下，细胞内的eNOS可以催化生成低浓度的NO来维持正常的心血管收缩功能。而iNOS在正常状态下表达水平极低，但在缺氧应激时可异常升高，且酶活力持续时间长，因而使NO过度生成，加重细胞损伤，而eNOS表达则被抑制[9]。过度生成的NO与机体氧化还原产物超氧阴离子自由基迅速反应生成过氧化亚硝酸离子(ONOO-)。ONOO-具有强氧化性,在酸性条件下可以分解形成如NO2+、NO2-、NO3-、OH-、OH和ONOO-·CO2加合物等多种有毒物质，促使细胞膜发生脂质过氧化，引起内皮细胞凋亡。本研究结果显示，缺氧时细胞eNOS表达显著降低而iNOS表达升高，但NO水平降低，推测缺氧时细胞活性氧产生增多，而内源性清除剂SOD水平降低，使得超氧阴离子自由基与生成的NO反应生成ONOO-，发挥毒性作用，从而表现为细胞活力和细胞存活率降低；预先给予各浓度蕨麻多糖干预均上调了eNOS水平，下调了iNOS水平，同时NO水平也升高，提示蕨麻多糖可通过调节不同亚型NOS的水平来调控NO的合成和释放，可能通过抑制超氧阴离子自由基与NO反应来起到细胞保护作用。

ET、NO都是血管内皮细胞释放的介质。ET-1具有强缩血管活性，NO则具有舒血管作用，二者在正常情况下处于动态平衡，共同维持血管的正常功能；二者失衡是动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的重要发病机制[10]。Teasauro等[11]提出ET和NO的失衡，损伤了血管稳态，是2型糖尿病患者发生血管功能障碍的主要原因。缺氧损伤后，内皮细胞释放的NO显著减少，而ET-1释放增加[12]，从而使内皮NO依赖性舒张功能受限。本研究结果显示缺氧状态下，内皮细胞ET-1水平升高，而NO水平降低，与文献报道一致。蕨麻多糖干预后可提高NO水平，降低ET-1水平。文献报道急性缺氧犬吸入NO后其血浆ET-1水平低于单纯缺氧犬，提示NO能抑制ET-1的生成[13]。因此蕨麻多糖在缺氧时可能通过维持NO水平来抑制ET-1的高表达，从而参与维护ET-1和NO的动态平衡，发挥对血管内皮细胞的保护作用。

综上所述，蕨麻多糖可通过提高EA、hy926细胞的抗氧化活性对缺氧损伤内皮细胞发挥保护作用；此外该保护作用还可能与其调控ET-1和NO的动态平衡有关。该保护作用是否与蕨麻多糖的浓度及作用时间有关，本研究未做分析，留待以后进一步研究探讨。

[1] 苏畅，王鲁君，张永亮，等.蕨麻正丁醇部位下调缺氧心肌细胞Cav 1.2及Ryanodine受体表达[J].武警后勤学院学报(医学版),2015,24(10):770-774.

[2] 卜婧，张永亮，李灵芝，等.蕨麻正丁醇提取物抑制大鼠海马神经元缺氧所致一氧化氮生成的研究[J].中国中西医结合急救杂志,2013,20(7):201-204.

[3] 杨硕，张岭，龚海英，等.蕨麻正丁醇部位下调缺氧内皮细胞HIF-1α及ET-1表达[J].天津中医药,2015,32(3):168-172.

[4] 唐琼琳,高宏生,刘丽华,等.急性高原缺氧大鼠脑皮质相关细胞因子变化及蕨麻的保护作用[J].中国中西医结合急救杂志,2012,19(3):137-140.

[5] 韦维，李广策，龚海英，等.蕨麻多糖抗缺氧作用初步研究[J]. 武警医学院学报,2010,19(5):345-347.

[6] 吴笳迪.多糖的作用及其研究进展[J]. 沈阳师范大学学报(自然科学版)，2008,26(2):221-223.

[7] 胡庭俊，郑荣梁.蕨麻多糖对小鼠免疫功能的调节与体内自由基水平关系的实验观察[J].广西农业生物科学,2007,26(s1):45-48.

[8] 张永慧，李月春，王宝军，等.蕨麻多糖对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制[J].内蒙古医学杂志,2014,46(4):385-388.

[9] Ester WA, Coen AS, Prter H, et al. Protective role of endothelial nitric oxide synthase[J]. J Pathol, 2003,56(1):8-17.

[10] Tang EH, Vanhoutte PM. Endothelial dysfunction: a strategic target in the treatment of hypertension[J]. Pflugers Arch, 2010,459(6):995-1004.

[11] Tesauro M, Cardillo C. Obesity, blood vessels and metabolic syndrome[J]. Acta Physiol(Oxf), 2011,203(1):279-286.

[12] McQuillan LP, Leung GK, Marsden PA, et al. Hypoxia inhibits expression of eNOS via transcriptional and posttranscriptional mechanism[J]. Am J Physiol, 1994,267(5 Pt 2):H1921-H1927.

[13] 郭子健，曹伟标，朱元珏，等.一氧化氮对急性缺氧性肺动脉高压及内皮素-1分泌的影响[J].中华结核和呼吸杂志，1999,22(6)：366.

Protective effect of Potentilla anserine L. polysaccharide on human umbilical vein endothelial cells after hypoxia injury

GEXiaojian1,ZHANGYongliang,SHIChaofeng,XUWei,LIJianyu,LILingzhi

(1TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China)

Objective To investigate the protective effect and mechanism of Potentilla anserine L. polysaccharide on human umbilical vein endothelial cells injured by hypoxia. Methods The cultured human umbilical vein endothelial cells (EA.hy926) were randomly divided into the normoxic control group, hypoxia model group, Fufangdanshen control group (with 0.1 mg/mL Fufangdanshen tablet extract) and high-, medium- and low-concentration Potentilla anserine L. polysaccharide groups (with 0.1, 0.05, and 0.025 mg/mL Potentilla anserine L. polysaccharide, respectively). In addition to the normoxic control group, the hypoxia injury models were constructed in the other five groups. The cells were cultured for 2 h. The metabolic activity and the survive rate of the cells were determined with MTT assay and Trypan-blue staining. The morphological changes of the cells were observed under light microscope. The levels of lactate dehydrogenase (LDH) and nitric oxide (NO) in the culture medium were detected by colorimetric method as well as the levels of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in cells. The levels of the inducible NO synthase (iNOS) and the endothelial NO synthase (eNOS) and the endothelin 1(ET-1) in culture medium were measured by ELISA. The expression levels of iNOS mRNA and eNOS mRNA was detected by RT-PCR. Results Comparing with hypoxia model group, the morphology of the cells were improved significantly, the cell viability and survival rate increased, cell LDH leakage decreased, iNOS and ET-1 levels decreased, eNOS and NO levels increased, SOD levels increased, MDA levels decreased, cell eNOS mRNA expression increased, and iNOS mRNA expression decreased in the Fufangdanshen control group and each Potentilla anserine L. polysaccharide group (allP<0.05). Conclusion The Potentilla anserine L. polysaccharide could have protective effect on the endothelial cells during hypoxia by improving anti-oxide activity of the cells, and the effect might be related to its regulation of dynamic equilibrium between ET-1 and NO.

hypoxia injury; Potentilla anserine L. polysaccharide; umbilical veins endothelial cells; nitric oxide; endothelin

国家自然科学基金资助项目(81471823)；天津市重点基金资助项目(12JCZDJC34700)；武警后勤学院创新团队课题项目(WHTD201303)。

葛肖健(1988-)，女，在读硕士，主要研究方向为天然产物的活性成分。E-mail：1012968746@qq.com

李灵芝(1963-)，女，教授，主要研究方向为组织缺氧缺血损伤及防治。E-mail：13682196000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.003

R852.11

A

1002-266X(2017)05-0008-04

2016-09-30)