eotaxin-3基因+2497、+77位点SNP与支气管哮喘易感性及类型的关系

熊晓琦，宋新宇，曾凡军，孟丽霞，阮玉姝，李文新

(三峡大学第一临床医学院·宜昌市中心人民医院，湖北宜昌443003)

eotaxin-3基因+2497、+77位点SNP与支气管哮喘易感性及类型的关系

熊晓琦，宋新宇，曾凡军，孟丽霞，阮玉姝，李文新

(三峡大学第一临床医学院·宜昌市中心人民医院，湖北宜昌443003)

目的 探讨嗜酸性粒细胞趋化蛋白(eotaxin-3)基因+2497、+77位点单核苷酸多态性(SNP)与支气管哮喘(哮喘)易感性、类型的关系。方法 选择哮喘患者196例(哮喘组)、经体检健康者196例(对照组)，其中哮喘组嗜酸细胞性哮喘(EA)140例、非嗜酸细胞性哮喘(NEA)56例。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测eotaxin-3 SNP，ELISA法检测血浆eotaxin-3水平。结果 哮喘组eotaxin-3+2497位TG基因型频率、等位基因G的频率高于对照组(P均<0.05)；两组+77位等位基因T的频率和各基因型频率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。NEA患者+2497位TG型频率高于EA患者(P<0.05)。TG型哮喘患者血浆eotaxin-3水平低于TT型哮喘患者(P<0.05)。结论 eotaxin-3+2497突变(T>G)与哮喘易感性及类型相关，而eotaxin-3+77位点SNP与哮喘易感性及类型无关。

支气管哮喘；嗜酸性粒细胞趋化蛋白；单核苷酸多态性；易感性

嗜酸性粒细胞趋化蛋白(eotaxin)家族包括eotaxin-1、eotaxin-2和eotaxin-3，通过与趋化因子3受体结合参与招募嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2细胞，从而在外周血和气道中激活嗜酸性粒细胞反应，在支气管哮喘(哮喘)发病中发挥关键作用[1,2]。目前研究发现，eotaxin的单核苷酸多态性(SNP)与哮喘易感性、外周血IgE及嗜酸性粒细胞(EOS)数量相关[3～5]。本研究检测哮喘患者eotaxin-3基因+2497、+77位点SNP，探讨其与哮喘易感性、类型及患者血浆eotaxin-3水平的关系，为哮喘治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月～2015年12月于本院就诊的哮喘患者196例(哮喘组)，均符合全球哮喘防治倡议有关哮喘的诊断标准。其中男92例、女104例，年龄(43.21±10.68)岁；第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1% pred)82%±15%，外周血总IgE水平(132±33)IU/mL，外周血EOS计数(0.45±0.22)×109/L，诱导痰中EOS百分比7.8%±3.1%。根据诱导痰中EOS百分比，将哮喘患者分为嗜酸细胞性哮喘(EA)140例(EOS>3%)和非嗜酸细胞性哮喘(NEA)56例(EOS≤3%)。排除有吸烟史、糖皮质激素治疗史、肺部有实质性病变及近4周有上呼吸道感染病史患者。同期选择经体检健康者196例(对照组)，男90例、女106例，年龄(45.32±13.35)岁；FEV1% pred 93%±12%，外周血总IgE水平(18.4±7.6)IU/mL，外周血EOS计数(0.05±0.02)×109/L，诱导痰中EOS百分比0.23%±0.16%。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)。患者均签署知情同意书。

1.2 eotaxin-3 SNP检测 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术。采集两组静脉血4 mL，取其中2 mL用苯酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，用PRIMER软件设计引物，eotaxin-3基因+77位引物：上游5′-TCAGGCAGGAGGAGTTTG-3′、下游 5′-GGCTTGTGGCTGTATTGG-3′)，+2497位引物：上游5′-GAAAGAGGCAAGAAAGTC-3′、下游 5′-AATCTGGGAGGAAACACC-3′。PCR反应体系25 μL，包括基因组100 ng，10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTPs各10 nmol，Taq DNA聚合酶1 U，Mg2+浓度2.0 mmol/L，不足体积用双蒸水补足。+77位PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 延伸5 min。+2497位PCR反应条件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 45 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 延伸5 min。用PCR-RFLP技术对eotaxin-3基因+2497位及+77位的2个SNP位点进行基因分型，酶切产物经4%琼脂糖凝胶电泳分离，用全自动数码凝胶成像仪分析结果。+77位酶切产物长度：TT为247 bp，CC为147、127 bp，CT为247、147、127 bp；+2497位酶切产物长度：TT为217、135 bp，TG为217、135、117 bp。

1.3 血浆eotaxin-3水平检测 取剩余的2 mL静脉血，4 ℃，3 000 r/min，离心10 min，取上层血浆置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测血浆eotaxin-3水平。

2 结果

2.1 两组eotaxin-3 +2497、+77位等位基因及基因型频率比较 +2497 T>G未检测到GG基因型，两组eotaxin-3 +2497和+77的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。哮喘组eotaxin-3 +2497位等位基因T、G的频率分别为88.5%(347/392)、11.5%(45/392)，对照组分别为97.7%(383/392)、2.3%(9/392)；哮喘组+77位等位基因C、T的频率分别为62.5%(245/392)、37.5%(147/392)，对照组分别为59.4%(233/392)、40.6%(159/392)。哮喘组eotaxin-3 +2497位等位基因G的频率高于对照组(P<0.05)，两组其他等位基因频率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。哮喘组TG基因型频率高于对照组(P<0.05)，两组其他基因型频率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 两组eotaxin-3 +2497位、77位基因型频率比较[例(%)]

2.2 EA与NEA患者eotaxin-3 +2497、+77位基因型频率比较 EA与NEA患者eotaxin-3 +2497位基因型频率比较差异有统计学意义(P<0.05)，+77位基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 EA与NEA患者eotaxin-3 +2497位、77位基因型频率比较[例(%)]

2.3 eotaxin-3 +2497位TT型和TG型哮喘患者血浆eotaxin-3水平比较 TT型哮喘患者血浆eotaxin-3水平为(0.84±0.31)ng/mL，高于TG型[(0.43±0.12)ng/mL]，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

目前认为气道炎症是哮喘时气道高反应性的重要原因，而EOS是其关键的效应细胞，EOS在气道的聚集是哮喘发病的一个重要环节，且EOS浸润是哮喘患者气道的主要病理改变之一。Eotaxin可特异性地趋化EOS聚集到支气管而引发气道炎症。eotaxin基因家族包括eotaxin-1、eotaxin-2和eotaxin-3，其同源性不足40%。研究显示，eotaxin-1与早期变态反应中的EOS浸润激活相关[6]，而eotaxin-2和eotaxin-3则与变态反应晚期EOS的增多活化关系密切[7～9]。eotaxin-3位于7q11.23染色体上，共有3个外显子和2个内含子，目前已经发现有7个SNP位点，其中有5个位于内含子区域，1个位于5′-非编码区，1个位于3′-非编码区。本研究中的eotaxin-3 +2497位和+77位分别位于3′-非编码区和内含子区域。

本研究发现，eotaxin-3 在3′-非编码区+2497 T>G基因多态性与哮喘易感性相关，而+77 C>T与哮喘的易感性无明显关系。eotaxin-3 +2497 T>G基因多态性与哮喘易感性相关这一结论与高贵民等[10,11]的研究结论相同。而+77 C>T与哮喘易感性不相关与霍婧等[12]的研究结果不一致，该研究发现eotaxin-3 C+77T可能是汉族儿童哮喘易感SNP位点，其中eotaxin-3 C+77T T/T纯合子基因型与哮喘发病密切相关；而Shin等[3]用直接测序的方法发现，eotaxin-3的+2497位、+77位与哮喘的关系并不密切，因此eotaxin-3在此两个位点的SNP与哮喘易感性的相关性可能还需更大样本的研究来验证。

目前有研究认为，eotaxin-3 +2497位点可能在EOS的募集和血浆总IgE水平的维持中起重要作用[11]。而eotaxin-3 +2497位点的SNP可能影响eotaxin-3的表达。Macdonald[13]认为，3′-非编码区序列能够控制mRNA的稳定性及其翻译效率。由此推断，eotaxin-3 +2497位点由TT型突变成TG型后，eotaxin-3的mRNA稳定性可能受到影响，从而影响其翻译效率，最终导致TG型血浆eotaxin-3的表达水平较TT型低，而本研究结果也证实了这一推论。本研究TT型哮喘患者血浆eotaxin-3的水平明显高于TG型和对照组，说明eotaxin-3 +2497突变(T>G)突变能影响eotaxin-3的血浆水平。且本研究发现，eotaxin-3 +2497位TG型的NEA患者比例高于EA患者，这说明eotaxin-3+2497T>G突变可能通过影响eotaxin-3的表达而影响EOS聚集，从而导致TG型哮喘患者诱导痰中的EOS比例降低。

综上所述， eotaxin-3 +2497 T>G与哮喘易感性、哮喘类型相关。eotaxin-3 +2497 T>G突变可影响哮喘患者血浆eotaxin-3水平，从而影响EOS的聚集。

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Relationship of eotaxin-3 +2497 and +77 SNP with types and susceptibility of bronchial asthma

XIONGXiaoqi,SONGXinyu,ZENGFanjun,MENGLixia,RUANYushu,LIWenxin

(TheFirstSchoolofClinicalMedicineofChinaThreeGorgesUniversity,YichangCentralPeople'sHospital,Yichang443003,China)

Objective To investigate the relationships of eotaxin-3 +2497 and +77 single nucleotide polymorphism (SNP) with types and susceptibility of asthma.Methods We recruited 196 healthy control subjects (control group) and 196 patients with asthma (asthma group), including 140 cease of eosinophilic asthma (EA) and 56 cases of non-eosinophilic asthma (NEA). The polymorphism, allele frequency and genotype frequency of eotaxin-3+77C>T, +2497T>G were detected by PCR-RFLP. ELISA was used to detect the level of eotaxin-3 in plasma. Results The genotype frequency of eotaxin-3+2497 TG and allele frequency of eotaxin-3+2497G in the asthma group were significantly higher than those of the control group (allP<0.05). However, the allele frequency of eotaxin-3+77T and genotype frequency of eotaxin-3+77 showed no difference between the asthma and control groups (allP>0.5). The frequency of eotaxin-3 +249 7 TG genotype in NEA patients was significantly higher than that in EA patients (P<0.05). The level of eotaxin-3 in TG genotype asthmatic patients was significantly lower than that in TT genotype (P<0.05).Conclusions Eotaxin-3 +249 7 mutation (T>G) is associated, but eotaxin-3+77 SNP is not associated with asthma susceptibility, eosinophilic asthma and non-eosinophilic asthma.

bronchial asthma; eotaxin; single nucleotide polymorphism; susceptibility

湖北省教育厅科研计划项目(B2015254)。

熊晓琦(1975-)，女，硕士，副主任医师，主要研究方向为支气管哮喘的基础及临床。E-mail：glacierxq@126.com

宋新宇(1979-)，男，博士，副主任医师，主要研究方向为间质性肺病、支气管哮喘的基础及临床。E-mail：songxinyuhxk@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.004

R562.25

A

1002-266X(2017)05-0012-03

2016-10-07)